脓毒症(sepsis)是重症监护病房(ICU)死亡的首要原因,目前治疗手段非常有限[1]!脓毒症是由感染因素(包括真菌、细菌、病毒等)引起的宿主免疫反应,是以全身炎症反应为主的综合征。严重脓毒症与短期死亡率升高密切相关,目前有研究证实严重脓毒症患者全身状况迅速恶化并使脓毒症患者进入免疫抑制状态,从而产生各种免疫相关的并发症[2]。近年来严重脓毒症发病率出现增加的趋势,尽管重症监护技术的进步降低了短期死亡率,但是远期不良预后的风险也同样增加。脓毒症的全身炎症反应的发生机制非常复杂,一定强度和范围内的炎症反应对于机体而言是有益的,但是如果超出一定限度则可能对机体造成严重损害,目前有超过100个随机临床试验已经表明通过调节脓毒症的免疫反应可以提高患者的生存率,但是许多方案并没有成为临床治疗中的选项[3]。目前有研究证明氧化应激机制、炎症反应以及线粒体功能障碍在脓毒症的发病过程中具有重要作用[4-7]。2007年日本学者Oshawa[8]证实了低浓度氢气可以通过选择性抗氧化机制对局灶性脑缺血再灌注损伤产生治疗作用。近年来关于氢气用于医学领域的研究越来越多,氢气也作为一种新型的医学气体分子获得广泛认可[1-]。目前有大量研究证实氢气吸入或富氢水均能改善脓毒症动物模型的死亡率,并明显减轻重要脏器的损伤,能够改善脏器功能。近年来随着新型高浓度氢气治疗设备的应用,高浓度氢气(67%)治疗各种疾病的研究也越来越多,并且取得了较好的临床效果[12,13]。理论上高浓度氢气吸入可以提高组织、细胞甚至细胞器等部位的氢气浓度,增强抗氧化作用。高浓度氢气用于治疗脓毒症的效果是否优于低浓度氢气,以及高浓度氢气的治疗作用的具体机制均需要进一步确认研究。本研究利用不同浓度氢气(67%,2%)吸入治疗脓毒症小鼠模型,观察高、低浓度氢气吸入治疗后对脓毒症小鼠的保护作用以及对小鼠脓毒症肺损伤的治疗作用,同时探讨高浓度氢气对脓毒症肺损伤的的保护作用机制。实验一:高浓度氢气吸入对脓毒症小鼠肺损伤的保护作用及机制目的:比较高浓度氢气(67%)与低浓度氢气(2%)吸入对脓毒症小鼠的治疗作用及对脓毒症小鼠相关肺损伤的保护作用。方法:采用盲肠结扎穿刺法制备中度、重度脓毒症小鼠模型,模型制备成功后1 h以及6 h均吸入不同浓度(67%、2%)氢气1h,实时监测氢气吸入过程中小鼠动脉血气,记录不同浓度氢气吸入治疗后中度、重度脓毒症小鼠模型7d存活情况;观察不同浓度氢气吸入治疗后肺部病理改变情况、肺部干湿重比;检测肺以及血中氧化产物、抗氧化酶和促炎细胞因子浓度的改变情况;检测肺组织核因子网织红相关因子2(Nrf2)的表达情况,同时观察67%氢气吸入对通过Nrf2基因敲除小鼠脓毒症模型存活率的影响,以及对脓毒症小鼠肺组织病理评分、肺泡灌洗液蛋白含量、肺部湿重/干重比以及髓过氧化物酶(MPO)活性等肺部炎症指标进行评价。结果:1.67%及2%氢气收入CLP组均可改善中度脓毒症小鼠7存活率(P<0.05),67%与2%氢气吸入相比可使中度脓毒症小鼠7d生存率从80%提升至90%(P<0.05);67%氢气可使重度脓毒症小鼠7d存活率显著提高(P<0.05)。2.67%浓度氢气及2%浓度氢气吸入均可减轻脓毒症的肺部损伤,包括减轻肺组织病理改变、降低肺部髓过氧化物酶活性、肺湿/干重比率、支气管肺泡灌洗液中蛋白含量,高浓度氢气相比低浓度氢气对于肺的保护作用更为显著(P<0.05);3.67%氢气吸入对脓毒症的治疗效果与提高抗氧化物酶活性(SOD、CAT)(P<0.05)、降低血液以及肺组织中氧化产物8-异前列腺素-F2α(8-iso-PGF2α)的浓度(P<0.05)、抑制促炎细胞因子高迁移率族蛋白(HMGB1)的表达水平相关(P<0.05);4.高浓度氢气吸入可使脓毒症小鼠肺组织中的Nrf2表达水平增加(P<0.05),但是对于Nrf2基因敲除脓毒症小鼠,氢气吸入并无显著的治疗效果(P>0.05)。结论:高浓度(67%)氢气、低浓度(2%)氢气吸入均可显著改善脓毒症小鼠的生存率,高浓度(67%)氢气吸入相比低浓度(2%)氢气效果更佳;高浓度氢气相比低浓度氢气对于脓毒症小鼠肺损伤具有更佳的保护作用,其机制可能与激活Nrf2信号通路、减少促炎细胞因子释放及减轻肺组织氧化损伤有关。实验二:Nrf2信号通路在高浓度氢气治疗脂多糖诱导急性肺损伤小鼠模型中的作用机制目的:本实验拟观察高浓度(67%)氢气对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤的保护作用,并进一步探讨Nrf2信号通路在氢气治疗急性肺损伤过程中的作用机制。方法:制备LPS肺损伤模型后1h与6h两个时间点均吸入67%浓度氢气1h,评估高浓度氢气治疗后肺组织病理损伤情况以及肺组织细胞凋亡情况,监测各时点支气管肺泡灌洗液各种促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1)和趋化因子(KC、MIP-1α、MIP-2、MCP1)水平,采用 Western-blot 检测 Nrf2 的表达,监测肺组织中NF-κB活性的表达状况。结果:1.吸入67%浓度氢气可以明显减轻LPS诱导的小鼠肺损伤,可以显著减轻肺组织的病理改变及评分,同时改善肺的氧合功能(P<0.05);降低支气管肺泡灌洗液中蛋白质浓度,降低肺湿/干重比,降低肺组织髓过氧化物酶反应活性(P<0.05);2.高浓度氢气吸入明显改善LPS诱导肺损伤的肺组织细胞凋亡,降低Caspase-3活性(P<0.05),以及减少TUNEL染色阳性细胞数量(P<0.05);3.高浓度氢气吸入改善脂多糖导致的肺组织炎症反应,降低了支气管肺泡灌洗液细胞总含量以及多形核粒细胞含量(P<0.05),同时降低促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1)和趋化因子(KC、MIP-1α、MIP-2、MCP1)水平(P<0.05);4.高浓度氢气吸入使LPS诱发肺损伤的组织NF-κB活性下降(P<0.05),这和调节炎症反应相关;5.高浓度氢气吸入显著增加LPS所致肺组织中Nrf2表达水平,而氢气对LPS所致肺损伤的Nrf2基因敲除型小鼠无明显保护作用。结论:氢气可有效改善脂多糖诱导的急性肺损伤,机制与激活Nrf2通路调控炎症反应和细胞凋亡有关。实验三:高浓度氢气保护脓毒症小鼠肺损伤的线粒体动力学机制目的:评估高浓度氢气吸入对脓毒症小鼠肺组织线粒体功能的影响,并初步探讨其机制。方法:通过采用盲肠结扎穿孔法(CLP)诱导脓毒症小鼠模型。24只小鼠分为四组(n=6):假手术组(Sham组),假手术组+高浓度氢气治疗组(Sham+67%H2组),盲插结扎穿刺组(CLP组)CLP组+高浓度氢气治疗组(CLP+67%H2组)。高浓度氢气治疗方案:分别于术后1 h和6 h吸入67%氢气1h。Sham组与CLP组不给予氢气吸入治疗,吸入33%02+67%N2。模型制备成功后24小时,将小鼠麻醉后取少量肺组织,进行线粒体分离提取,测定呼吸控制率(RCR)、线粒体膜电位、评价线粒体呼吸链复合体状况。同时测定4组小鼠术后24h肺组织线粒体分裂蛋白drp1和线粒体融合蛋白mfn2的蛋白表达水平。结果:1.与Sham组相比,CLP组小鼠在线粒体呼吸链复合体I活性以及肺组织线粒体的呼吸控制率(RCR)、膜电位水平(MMP)方面明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。CLP+67%H2组与CLP组相比,两组肺组织线粒体呼吸链复合体II活性的差异无统计学意义(P>0.05),线粒体RCR、MMP显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.与Sham组相比,CLP组小鼠肺组织drp1蛋白表达增多,mfn2蛋白表达下降。与CLP组比较,CLP+67%H2组drp1蛋白表达下降,mfn2蛋白表达上升。结论:1.脓毒症小鼠肺组织线粒体功能下降,高浓度氢气吸入治疗可显著改善肺组织线粒体的功能。2.高浓度氢气吸入治疗可明显改善线粒体动力学平衡,调控线粒体分裂蛋白drp1与融合蛋白mfn2的表达,改善线粒体功能,减轻脓毒症小鼠肺组织损伤。小结1.氢气吸入能够改善脓毒症小鼠生存率,减轻脓毒症小鼠模型晚期炎症因子释放,高浓度氢气相比低浓度氢气更能减轻肺组织炎症损伤,此保护作用和氢气改善氧化应激、调节炎症反应以及Nrf2信号通路相关;2.高浓度氢气吸入可有效改善脂多糖诱导的急性肺损伤,其机制与Nrf2信号通路介导的炎症反应和细胞凋亡有关,同时核转录因子NF-κB也参与了氢气对脓毒症小鼠肺损伤的保护作用;3.线粒体动力学机制在脓毒症小鼠肺损伤中具有重要作用,氢气治疗作用可能通过调节线粒体分裂与融合而维持线粒体动力学平衡,改善线粒体呼吸功能而实现。