基于蛋白和核酸的副溶血弧菌鉴定与分型研究

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目的:1.利用多位点序列分型技术(Multilocus sequence typing, MLST)研究我国辽宁、浙江和广州地区的副溶血弧菌型别分布,比较3个地区的型别分布差异,分析其种群结构、进化趋势及流行特性;2.应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)构建副溶血弧菌质谱图谱数据库,增加数据库中副溶血弧菌图谱的多样性,提高其鉴定准确率,同时对蛋白质谱数据进行统计分析;3.比较基于核酸的多位点序列分型技术和基于蛋白的质谱数据分析结果,拟从核酸和蛋白2个层面阐释副溶血弧菌的进化流行趋势。  方法:1. PCR扩增副溶血弧菌7个管家基因,根据7个管家基因的核酸序列信息获得其等位基因型(allele)以及序列型(Sequence Type, ST);2. DnaSP5.0以及eBURST Version3.0分析序列多样性,SplitsTree4、 STRUCTURE等软件分析副溶血弧菌种群结构特征;3.利用MALDI-TOF MS技术构建副溶血弧菌质谱图谱数据库,增加数据库中副溶血弧菌参考图谱信息;4.应用Biotyper软件对质谱图谱数据进行聚类分析,从蛋白水平阐述副溶血弧菌的聚类关系。  结果:1.辽宁、浙江和广州地区307株副溶血弧菌共160个序列型,其中117个为新序列型。辽宁地区57株副溶血弧菌共47个序列型,新序列型24个,浙江地区152株副溶血弧菌共36个序列型,其中新序列型23个,广州地区97株副溶血弧菌共78个序列型,其中71个为新序列型;2.副溶血弧菌在3个地区内部及3个地区间均存在显著的重组现象。SplitsTree4种群结构分析结果显示,160个序列型共分成2个分支,STRUCTURE种群结构分析将160个序列型分为3个亚群;3.共构建334株副溶血弧菌质谱图谱数据库,包括临床株和环境株,增加了数据库中参考图谱多样性;4. MALDI-TOF MS聚类分析结果显示,辽宁地区和广州地区副溶血弧菌蛋白图谱峰聚集在一个分支上,且与浙江菌株间存在一定的差异,但是仍有部分广州菌株与浙江菌株聚集在同一个分支;5.比较基于核酸的序列分析结果与基于蛋白质谱的聚类分析结果显示,2种分析结果不存在明显的联系;6.利用MALDI-TOF MS对广州地区临床株与环境株进行聚类分析,结果显示临床株和环境株在质谱聚类上不能完全区分;7.浙江地区 O3:K6和 O4:K8血清型MALDI-TOF MS聚类分析结果显示,MALDI-TOF MS在副溶血弧菌 O3:K6和O4:K8血清分型上具有潜在能力。  结论:1.307株副溶血弧菌MLST分析表明副溶血弧菌序列型具有高度多样性,且7个等位基因也存在高度的多样性。副溶血弧菌在3个地区内部及3个地区间均存在显著地重组现象;2.种群结构分析结果显示,307株副溶血弧菌共160个序列型大致分成2个亚群,其中一个亚群内部有19个序列型相较于其他副溶血弧菌而言,同源性较高,形成一个亚克隆;3.对334株副溶血弧菌质谱数据聚类分析结果显示,辽宁和广州地区的副溶血弧菌质谱图谱存在一定的相似性,且与浙江地区的存在一定差别,但有部分广州菌株的质谱图谱与浙江地区也存在一定的相似性;4.广州地区副溶血弧菌临床株和环境株在蛋白质谱水平无法区分;5.副溶血弧菌MLST分型与基于蛋白质谱分型结果暂时没发现明显的联系;6. MALDI-TOF MS在副溶血弧菌O3:K6和O4:K8血清分型上具有潜在能力。
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