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多形性胶质母细胞瘤是成人常见的颅内原发性肿瘤，呈高度恶性，治疗困难，预后差。目前围绕脑胶质母细胞瘤的治疗存在两大难题：肿瘤恶性程度高和肿瘤侵袭性强。随着基础研究的深入，越来越多的证据证明肿瘤的发生、发展是在体内、外因素影响下，多个基因结构和功能发生改变的结果。目前还没有发现胶质母细胞瘤发生、发展过程中的多个环节上起作用的关键性调控基因。抑制性消减杂交（SSH）是近年发展起来的一项研究基因的差异表达及相关基因的分子克隆新技术。因其具有高敏感性、效率高，高特异性，自其问世以来被许多学者广泛应用于克隆差异表达的基因。 本实验希望通过抑制性消减杂交方法发现多形性胶质母细胞瘤与低级别胶质瘤的差异表达基因，从而筛选出与肿瘤侵袭、增生相关基因，然后通过分子生物学方法进行差异基因克隆的功能研究。 1、差异基因的克隆 目的：使用抑制性消减杂交等分子生物学技术构建多形性胶质母细胞瘤和Ⅰ级星形细胞瘤之间差异表达的cDNA片段组成的消减文库，从中克隆出多形性胶质母细胞瘤增殖、侵袭相关基因。 方法：实验中分别对临床采取的多形性胶质瘤和Ⅰ级星形细胞瘤标本提取总RNA，柱状层析获得mRNA，紫外分光检测所得RIgA和mRNA的A260／A280的比值为1.87、1.90，表明其质优和量足，琼脂糖凝胶电泳检查RNA提示出现明显的18S和28S条带，比值约为2：1，mRNA为大于0.5kb清晰彗星尾状条带，完整性良好。 然后分别设立实验方和驱赶方，用AMV逆转录酶和cDNA合成随机引物合成cDNA第一链和第二链。用Rsa Ⅰ内切酶进行酶切，形成cDNA短片段，经电泳鉴定显示未经消化的cDNA为0.5-10kb淡淡的条带，和mRNA的大小相一致，消化后的cDNA的条带集中分布在0.5-1.0kb之间，在0.1-0.5kb之间可以看到非第二军医大学博士学位论文中文摘要常淡的条带，表明消化进行的充分。 实验方双链cDNA分成两组，用T4 DNA连接酶分别连上接头1和接头2，然后用两接头特异性引物和G3PDH基因特异性引物扩增跨越接头和特异性基因的片段鉴定连接效率，经28个循环的PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示在在0.75kb处有明显的条带，连接效率大于50%，即50%以上的dscDNA已经与接头连接，然后进入下一步实验。 实验方两组胶质母细胞瘤cDNA分别和过量的驱赶方I级星形细胞瘤留cDNA进行第一次正向消减杂交，然后两组之间再加上过量己经高温变性的驱赶方cDNA进行第二次消减杂交。同样以和不同接头连接的I级星形细胞瘤留cDNA为实验方、以多形性胶质母细胞瘤为驱赶方进行反向消减杂交。两次消减杂交结果两端连接有不同接头的差异基因片段得到富集，同时为下一步进行特异J性PCR扩增打下基础。 利用巢式PCR的原理，对经过消减后的两端分别连接有不同接头的差异性双链cDNA进行扩增富集。首先利用一对接头特异性的外侧引物进行第一次PCR扩增;然后利用另一对接头特异性内侧引物进行第二次PCR扩增，同时和未经消减杂交的样本进行PCR对照。产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果提示差异基因得到富集，消减后的cDNA经PCR扩增后条带减少，主要集中在0.5一0.gkb之间。未经消减的条带弥散，条带多。然后通过PCR反应比较看家基因G3PDH在消减前后的丰度变化进行PCR消减效率分析。分别以G3PDHS’引物、G3PDH3’引物对稀释未杂交扩增的实验对照和稀释杂交扩增后的cDNA进行18、23、28和33个循环PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果提示与非抑制性PCR产物相比，抑制性PCR产物中非特异性表达G3PDH基因产物大大减少。 经过两轮消减杂交和两轮抑制性PCR，得到。DNA消减文库。将经过PCR扩增的差异基因片段连接到质粒载体PMD 18一T中，然后用冰浴热休克的方法转化感受态大肠杆菌JM 109进行扩增。随机挑取阳性克隆进行质粒抽提，Ban1HI和Hindlll双酶切，结果提示60个正向消减文库克隆和40个反向消减文库克隆均第二军医大学博士学位论文中文摘要载有500一70obp大小的片段，和理论设计大小相符合。然后随机挑选阳性克隆进行M13正向引物测序，得到差异基因的序列。登录GENE BANK（httP:刀ncbi.ulm.gov/BLAsT）检查是否为新序列;登录httP://ncbi.nlm.go讥ocusLi耐确定其染色体定位。 结果:正向消减得到620个阳性克隆，反向消减得到460个阳性克隆，质粒酶切结果显示正向、反向消减文库克隆均载有500一700bP大小的片段。正向消减杂交得到10个和已知序列具有高度同源性的片段，分别为细胞膜蛋白、核蛋白和代谢酶编码基因，其余正向消减克隆测序得到的序列和已知EST序列的同源性均低于85%，没有高度同源性的片段。反向抑制性消减杂交克隆测序得到的序列与己知EST序列的同源性在45%到85%之间，也没有检索到具有高度同源性的片段。 结论:抑制性消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法;多个cDNA序列可能与胶质母细胞瘤增殖和侵袭性相关。2、差异基因U77949在多形性胶质母细胞瘤、间变型星形细胞瘤留和I级星形细胞瘤中表达的半定量分析 目的:对差异表达基U77949片段在在多形性胶质母细胞瘤、间变型星形细