研究背景和目的：　　 临床上心律失常的发生常和心肌细胞离子通道的功能障碍有关。由人类human ether-a-go-go相关基因(hERG)编码的快速激活延迟整流钾通道(rapidactivating delayed rectifier K+ channel,Ikr)在人类生理和病理过程中起着重要作用。人类心肌细胞中,hERG钾通道影响心脏动作电位的复极化过程,是绝大多数药物引起心肌细胞QT间期延长作用的靶点。目前临床广泛使用的各种非心血管药物如抗精神病药、抗疟药、抗菌药、抗组胺药等对心肌细胞膜上hERG通道产生的钾电流有阻断作用,导致QT间期延长,可产生多形性室速、尖端扭转型室性心动过速(Torsades de pointes,Tdp)或室颤。长QT综合征(LongQT syndrome,LQTS)可分为遗传性LQTS和获得性LQTS二类。目前临床上发现的多为获得性LQTS。阿扎那韦是新型的蛋白酶抑制剂,在临床上与其他的蛋白酶抑制剂及逆转录酶抑制剂合用治疗艾滋病。临床发现,随着医疗卫生条件的提高,HIV患者的寿命也在不断延长,但是心律失常在这些人群中的发生率也在不断升高,表现为QT间期延长,P-R间期延长等。但是这些患者本身可能没有心脏疾病。推测HIV患者的心律失常可能与服用药物有关。阿扎那韦的同类药物在临床应用中有致心律失常的风险,能引起LQTS,甚至发生Tdp,导致心源性猝死,而且已在体外实验中被证实能引起QT间期延长。但是目前文献中对阿扎那韦致QT间期延长的临床报道是有争议的,甚至是矛盾的,也缺乏关于体外实验的报道。因此,本课题将着力探讨阿扎那韦致QT间期延长的可能分子机制,为指导临床个体化给药提供理论依据,降低患者心脏不良反应的发生率。　　 材料与方法：　　 1.药物　　 阿扎那韦购于美国sigma公司,溶于甲醇中配制成10 mM的母液,室温保存。实验时用DMEM或正常台氏液稀释成不同浓度的阿扎那韦。甲醇的终浓度小于0.1％时,对hERG钾电流的记录无显著影响。　　 2.HEK-293细胞的培养及瞬时转染　　 人类胚胎肾细胞(human embryonic kidney cell line,HEK-293)在含有10%优级胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中培养,并放置在37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养并传代。当细胞长至70～80%密度左右时,用0.25%的胰酶消化传代,根据实验目的的不同以相应密度接种于培养皿中继续培养。参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行脂质体转染,转染的质粒类型如下:①野生型pcgi-WT-hERG②突变型pcgi-Y652A-hERG和pcgi-F656C-hERG。　　 3.应用全细胞膜片钳技术记录hERG钾通道电流　　 在荧光显微镜下找出有绿色荧光的单个HEK-293细胞,采用全细胞膜片钳技术,根据不同的实验方案,分别记录阿扎那韦对野生型hERG、突变型Y652A-hERG和F656C-hERG钾通道电流及其动力学特征的变化。　　 4.Western blotting方法检测hERG蛋白的表达　　 阿扎那韦孵育24 h后,胰酶消化收集细胞,RIPA裂解提取蛋白,BCA法测蛋白浓度,9%的SDS-PAGE凝胶电泳,PVDF转膜,5%脱脂奶粉室温封闭,抗hERG一抗(1:400),4℃孵育低速摇床过夜,HRP标记的二抗(1:10000),室温孵育1 h,ECL化学法显色。通过Quantity one软件分析胶片中每条带的灰密度值,并与自身内参GAPDH条带的灰密度相比,以对每条带完成半定量分析。　　 5.激光共聚焦技术定位hERG蛋白　　 将经阿扎那韦孵育24 h的转染有WT-hERG钾通道的HEK-293细胞应用激光共聚焦技术进行定位,FITC(绿色)和DAPI(蓝色)应用波长分别为488和408 nm的激光激发。　　 6.统计学处理　　 采用mean±S.E.M进行数据处理,SPSS12.0软件作统计学分析,用Origin6.0软件制图,统计学比较采用单因素方差分析和配对t检验进行。以α=0.05作为检验水准。　　 结果：　　 1.阿扎那韦直接抑制野生型WT-hERG钾电流(Ikr)　　 将转染有hERG基因的HEK-293细胞分别给予0.01、0.1、1、3、10和30μM的阿扎那韦,同时记录hERG电流的变化。阿扎那韦对野生型WT-hERG电流呈浓度依赖性抑制,抑制率依次为(11.95±2.65)%、(22.60±5.29)%、(34.22±8.52)%、(41.36±9.80)%、(55.80±4.69)%和(73.22±7.02)%。阿扎那韦对WT-hERG电流的IC50值为5.73±1.81μM,Hill系数为0.38±0.06。阿扎那韦对WT-hERG的激活曲线作用的结果显示:加药前的半数激活电压(V1/2)为12.53±0.66 mV,激活斜率(k)为13.62±0.58 mV,而加入10μM阿扎那韦后的V1/2为17.81±0.82mV,k为15.01±0.72 mV,经统计学处理无显著性差异(P＞0.05)。阿扎那韦对WT-hERG的失活曲线作用的结果显示:加药前的半数失活电压(V1/2)为-61.06±0.94 mV,失活斜率(k)为24.13±0.86 mV,而加入10μM阿扎那韦后的V1/2为-56.28±1.12 mV,k为23.72±1.03 mV,经统计学处理也无显著性差异(P＞0.05)。由阿扎那韦对突变体Y652A-hERG及F656C-hERG钾通道的作用可以看到,10和30μM阿扎那韦对突变体Y652A-hERG钾通道的抑制率分别为(30.83±2.87)%和(39.19±2.74)%。与野生型相比,Y652A-hERG的突变一定程度上削弱了阿扎那韦抑制WT-hERG钾通道的能力。在HEK-293细胞中F656C-hERG的表达量很低,不易引出外向电流,因此我们用高钾的细胞外液引出其内向电流。当阿扎那韦的浓度为10和30μM时,其对WT-hERG钾通道内向电流分别抑制了(35.44±1.22)%和(47.91±5.67)%;而对F656C-hERG钾通道则分别抑制了(15.31±5.0)%和(18.41±4.7)%。可见,F656C-hERG的突变同样明显削弱了阿扎那韦抑制WT-hERG钾通道的能力。　　 2.阿扎那韦对hERG蛋白运输的影响　　 将转染有hERG基因的HEK-293细胞分别给予0.1、0.3、1、3、10和30μM的阿扎那韦孵育,24 h后提蛋白进行Western blot检测。结果显示:与对照组相比,155 kDa条带的灰密度值随着阿扎那韦浓度的增大而减少,阿扎那韦对hERG钾通道蛋白的表达呈浓度依赖性的抑制,经统计学处理有显著性差异(P＜0.05 vscontrol)。　　 3.共聚焦技术对hERG蛋白的亚细胞定位　　 结果显示hERG钾通道蛋白主要在细胞膜上。阿扎那韦处理后细胞膜上的绿色荧光强度明显减弱,荧光主要分布于细胞质中。　　 结论：　　 阿扎那韦对HEK-293细胞上hERG钾通道的抑制与其直接阻断hERG钾通道电流和间接抑制hERG蛋白向细胞膜的转运有关。