论文部分内容阅读
目的原发性肝癌(HCC)是一种全球性的高度恶性肿瘤,起病隐匿,易复发转移,致癌机理尚未阐明。肿瘤干细胞是肿瘤中一群具有自我更新,致瘤,化疗抵抗,易复发转移等于性特征的细胞亚群。CD90分子是肿瘤干细胞的表面标志物之一。近年来研究发现,Notch信号通路参与调控多种肿瘤干细胞的干性维持。本课题旨在研究异常激活或抑制的Notch信号通路如何调控CD90+肝癌干细胞的干性特征,以期揭示肝癌干细胞的致癌机制,为肝癌的诊断和治疗提供新思路。方法通过对31对肝癌和相应癌旁组织的免疫组化(IHC)分析,我们获得CD90的临床病理联系。流式检测各肝癌细胞系CD90的表达水平,选择合适的细胞系用免疫磁珠从中分选CD90+细胞群,进行平板克隆,Transwell侵袭和迁移实验,索拉菲尼处理细胞,裸鼠成瘤实验鉴定该细胞的干性特征。qRT-PCR检测CD90+细胞化疗抵抗基因和干性基因的表达,皆以CD90-细胞为阴性对照。qRT-PCR和WB检测两种细胞中Notch信号通路相关分子的表达。通过功能获得(激活剂Jagged1上调Notch信号通路)和功能丧失(慢病毒干扰载体LV-Notchl-si抑制Notch号通路)实验,同时流式分析检测细胞周期和凋亡,qRT-PCR和WB检测G1-S期转化相关基因和凋亡相关基因,探讨Notch信号通路调控CD90+细胞的分子机制。结果(1)免疫组化分析结果示在31对肝细胞癌和癌旁组织中,癌组织CD90,Notchl, Nanog, Sox2的表达均高于癌旁(P<0.05)。对31例肝癌患者的临床资料进行回顾性分析,发现CD90高表达与患者的门脉侵袭密切相关。(2)流式检测七株肝癌细胞系CD90表达范围从0.3%±0.2%到91.1%±4.0%。肝癌细胞系PLC/PRF/5和Huh7中CD90表达强度适中,可进行磁珠分选获得CD90+细胞,并进行干性鉴定,结果示其有强大的体内外成瘤能力,细胞侵袭和迁移能力,分化能力,化疗抵抗能力,并高表达化疗抵抗基因和干性基因,CD90-细胞作为对照。(3) qRT-PCR和WB检测CD90+细胞Notch信号通路相关分子(Notchl,NICD, Hes1, Hey1)的表达升高,CD90-细胞作为对照,表明CD90+细胞中Notch信号通路激活。激活剂Jagged1上调CD90-细胞Notch信号通路,CD90-细胞获得显著提高的成瘤能力,侵袭和迁移能力,其干性基因表达提高。慢病毒干扰载体LV-Notch1-si抑制CD90+细胞Notch信号通路,其成瘤能力,侵袭和迁移能力显著下调,干性基因表达降低。(4)CD90-细胞Notch信号通路激活后,流式检测细胞周期G1期缩短S期延长,促进G1期向S期转换,其相关基因表达升高,凋亡相关基因表达不变。LV-Notch1-si抑制CD90+细胞Notch信号通路后,G1期延长S期缩短,阻滞G1期向S期转换,其相关基因表达降低,凋亡相关基因表达增高。结论我们的研究证实,肝癌组织中CD90强表达与患者的不良预后相关,CD90+细胞是一群具有自我更新,致瘤,化疗抵抗,复发转移等干性特征的细胞亚群,CD90是一个可靠的肝癌干细胞标志物。Notch信号通路在CD90+细胞中处于激活状态,可通过影响周期和凋亡调控CD90+细胞的干性能力。此项研究为肝癌干细胞理论提供了新的实验依据,并为靶向CSCs的治疗提供了新的策略。