紫杉醇是目前临床上广泛应用的抗肿瘤药物,其可以治疗多种人类肿瘤,包括乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、头颈部癌以及结肠癌等。但是,紫杉醇在实际化疗应用中却受到诸如溶解度低、药动学特性不良以及肿瘤对其摄取缺乏选择性等原因的限制。尤其紫杉醇水溶性极差,临床应用的紫杉醇(Taxol)用50%的聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和50%的乙醇来作为辅料,Cremophor EL是注射紫杉醇治疗癌症临床应用中引起超敏反应和众多不良反应的最主要原因。抗癌药物的一个备受关注的发展方向是聚合物治疗法。多聚物治疗法包括聚合物-蛋白质偶合物、聚合物-药物偶合物,以及超分子药物传递系统。聚合物-药物偶合物是指将适当的聚合物载体、生物可降解的交联剂和具有生物学活性的抗肿瘤药物结合起来,其能够提高临床应用抗癌药物的治疗指数。PG-TXL(PPX,CT-2103,XYOTAXTM)是一种水溶性大分子聚合物,其通过将紫杉醇连接到L-聚谷氨酸上而形成,偶合物PG-TXL在体循环中较为稳定,其通过内吞作用进入细胞后,能够被细胞内的溶酶体酶类所破坏从而释放活性药物。临床前研究表明PG-TXL与紫杉醇相比,其在溶解度、抗癌治疗效能、组织摄取、肿瘤部位驻留以及药动学特性方面都有很大的提高。本课题研究的我所自主研发的水溶性多聚(L-谷氨酸)-丙氨酸-紫杉醇偶合物(poly (L-glutamic acid)-alanine-paclitaxel conjugate,PG-PTX)即通过丙氨酸将多聚(L-谷氨酸)与紫杉醇连接,也避免了使用Cremophor EL,从而改变了药物的药动学活性和生物分布,无需治疗前给药,减少不良反应,达到增强抗癌药物治疗活性、减少抗癌药物毒性的目的。该药物的溶解度较紫杉醇提高了80000多倍,紫杉醇从无活性的偶合物中缓慢释放,分布相和消除相延长,并可能具有被动肿瘤靶向作用。紫杉醇-氨基酸偶合物药物(TOX-aa-Na)是我所自主设计研发的另一类紫杉醇偶合物药物,其通过氨基甲酸酯结构将几种不同的氨基酸分别与紫杉醇连接起来,水溶性也得到了提高,同时避免了使用Cremophor EL而带来的不良反应。本课题旨在考察紫杉醇大分子偶合物药物和小分子偶合物药物这两大类修饰药物的药动学特性等,为紫杉醇偶合物药物结构优化和研发提供临床前可靠依据。本论文从以下几个部分对紫杉醇偶合物药物进行了研究:第一部分:大分子紫杉醇偶合物药物的药代动力学性质研究1、PG-PTX质量控制测定确定227 nm作为PG-PTX及CT-2103载药量测定的紫外检测波长,制备紫杉醇浓度-光吸收值标准曲线,求算PG-PTX及CT-2103中紫杉醇的载药量。建立HPLC方法测定PG-PTX中游离紫杉醇的含量,根据紫杉醇浓度-峰面积标准曲线求算PG-PTX中游离紫杉醇的含量。2、紫杉醇含量测定的方法学建立与确证本实验建立的测定大鼠血浆、小鼠血浆、小鼠组织匀浆等生物基质中紫杉醇含量的LC-MS/MS方法分析速度快、灵敏度高、特异性好,采用了液-液萃取方法对样本中的紫杉醇进行萃取,萃取回收率高。该方法日内日间精密度、准确度及提取回收率均满足生物样品定量分析要求。3、PG-PTX在不同介质中稳定性考察PG-PTX在醋酸盐(pH 4.0)和磷酸盐(pH 7.4)中释放紫杉醇的速率均较CT-2103在醋酸盐和磷酸盐中释放紫杉醇的速率快。PG-PTX和CT-2103在pH 4.0条件下释放的紫杉醇均少于其在pH 7.4条件下释放的紫杉醇。PG-PTX在大鼠、犬、猴、人血浆中(37°C)孵育0 -12 h,释放出来紫杉醇的量逐渐增多,12 h孵育点以后释放的紫杉醇的相对量反而呈下降趋势。CT-2103中紫杉醇的释放慢于PG-PTX中紫杉醇的释放。PG-PTX和CT-2103在大鼠肝匀浆中(37°C)孵育24 h内释放出来紫杉醇的量逐渐增多,但是相同孵育时间PG-PTX和CT-2103中释放出来紫杉醇的量前者明显多于后者。4、PG-PTX大鼠体内药代动力学研究SD大鼠尾静脉注射给药10 mg/kg Taxol、10 mg/kg(紫杉醇等摩尔剂量)PG-PTX和10 mg/kg(紫杉醇等摩尔剂量)CT-2103,三个药物的t1/2和MRT没有统计学差异,而三个药物的AUC0-12、AUC0-∞、Vz及Cl均具有明显的统计学差异。给药紫杉醇后血药浓度高,消除快,而给药PG-PTX和CT-2103后血中药物则缓慢消除。大鼠给药12 h内血中游离紫杉醇浓度PG-PTX组高于CT-2103组。5、PG-PTX小鼠组织分布研究昆明小鼠尾静脉注射给药10 mg/kg Taxol、10 mg/kg(紫杉醇等摩尔剂量)PG-PTX和10 mg/kg(紫杉醇等摩尔剂量)CT-2103,给药Taxol后血浆和组织中的游离紫杉醇作用迅速,消除快,而给PG-PTX及CT-2103后缓慢释放紫杉醇,给药PG-PTX及CT-2103约24 h后血浆和大多数组织中的游离紫杉醇浓度高于相同作用时间点给药Taxol组。第二部分小分子紫杉醇偶合物药物的药代动力学特性研究1、小分子紫杉醇偶合物药物的体外稳定性研究TOX-aa2-Na在生理盐水、大鼠血浆、人血浆和人肝微粒体中的稳定性差于TOX-aa1-Na和TOX-aa3-Na。TOX-aa1-Na,TOX-aa2-Na和TOX-aa3-Na在大鼠血浆中的稳定性低于其在生理盐水中的稳定性。TOX-aa1-Na,TOX-aa2-Na和TOX-aa3-Na在生理盐水、大鼠血浆、大鼠肝匀浆、人血浆和人肝微粒体中孵育2、4和8 h,原型药物的含量随着孵育时间的增加而减少,但是孵育体系中均没有检测到游离紫杉醇。2、小分子紫杉醇偶合物药物的大鼠体内药代动力学研究大鼠尾静脉注射10 mg/kg(紫杉醇等摩尔剂量)TOX-aa1-Na 2 min后原型药物消除很快,但是血浆中始终没有检测到游离紫杉醇。第三部分大分子紫杉醇偶合物药物的细胞内药物测定及细胞转运特征研究1、大分子紫杉醇偶合物药物的细胞内药物测定给予低(20μg/mL)、中(100μg/mL)、高(500μg/mL)三个浓度的紫杉醇和PG-PTX(紫杉醇等摩尔剂量)作用24 h细胞内活性紫杉醇药量高于作用12 h细胞内活性紫杉醇药量;加入P-gp抑制剂后紫杉醇组细胞内活性紫杉醇药量明显提高,而PG-PTX组无明显变化;给予相同浓度紫杉醇和PG-PTX且作用相同时间,PG-PTX组细胞内活性紫杉醇药量不但明显高于给紫杉醇组,而且高于加入抑制剂后的紫杉醇抑制剂组。2、大分子紫杉醇偶合物药物的细胞转运特征研究紫杉醇在高表达P-gp的MDCK-MDR1单层细胞上受到转运蛋白P-gp的抑制,而在低表达P-gp的MDCK细胞株中紫杉醇给药组不受P-gp抑制剂的影响,PG-PTX给药组在MDCK和MDCK-MDR1细胞株中均不受P-gp抑制剂的影响。第四部分PG-PTX大分子测定的方法学初探1、酸水解法PG-PTX酸水解的最终稳定片段即284片段标准品质谱检测的定量下限为5 ng/mL;大鼠血浆中284片段标准品在3 N HCl作用下用乙酸乙酯提取后检测分析,284片段定量下限为10μg/mL;PG-PTX药液以3 N HCl于85°C恒温水浴中水解2 h再用乙酸乙酯提取后检测分析,PG-PTX药液定量下限为1μg/mL;大鼠血浆中PG-PTX药液先以甲醇沉淀血浆蛋白,上清液以3 N HCl于85°C恒温水浴中水解2 h再用乙酸乙酯提取后检测分析,大鼠血浆中PG-PTX药液定量下限为10μg/mL。该酸水解方法需要继续摸索和改进,以期最终实现通过284片段对生物样品中的PG-PTX进行定量。2、酶水解法大鼠血浆中PG-PTX药液以枯草杆菌酶55°C孵育,样品用甲基叔丁基醚(TBME)提取后检测分析。该方法需要继续摸索以PG-PTX酶水解后检测到紫杉醇的量与酶水解前生物样品中PG-PTX的量建立线性关系良好的标准曲线,以检测到的紫杉醇的量对PG-PTX进行定量。