前言基因芯片的发明对生命科学研究起到了巨大的推动作用,其高通量、并行化检测的特点在基因分型、基因诊断等方面具有独特的优势。目前应用基因芯片进行分型的过程一般是:1、DNA阵列的构建;2、样品DNA或mRNA的制备;3、分子杂交;4、杂交图谱的检测和分析。在我们的研究过程中发现基因芯片也存在许多不足之处:1.基因芯片的步骤复杂,对操作者要求较高;2.芯片杂交后,样品DNA与芯片上的探针结合稳定性不好,清洗时容易造成样品DNA脱落,影响杂交信号强度;3.用基因芯片进行单碱基多态分析时,对探针的设计和杂交条件要求及其严格。为了解决以上几个方面的问题,本研究构建了新型的“核酸探针原位延伸基因芯片”。该芯片解决了基因芯片操作步骤繁琐的问题,提高了基因芯片的准确性和特异性,并且可专门用于单个碱基多态的检测。该芯片在设计探针时将基因序列的变异位点作为探针序列的3’端,设计了4条序列一样,3’末端分别为A,T,C,G的探针,然后将探针固定到芯片上。反应时,首先在溶液中进行样品DNA的PCR扩增,当样品DNA达到一定的浓度即可与芯片表面的探针进行PCR延伸反应。此时,探针3’末端与样品DNA不完全配对的探针点不发生延伸反应,探针与样品DNA结合不稳定,而两者完全配对的探针点经过延伸后,结合稳定。反应完成后经过清洗检测信号即可知样品DNA序列在探针3’位点的碱基类型。本研究为了保证实现以上的反应过程,制作了专门用于该基因芯片反应的空气变温PCR扩增仪和原位延伸基因芯片盒。本研究为了验证了“核酸探针原位延伸基因芯片”的准确性和可靠性,用该基因芯片对乙型肝炎病毒进行了基因分型。实验方法一、实验材料临床血清标本来自中国医科大学第一临床医院检验科PCR试剂盒（NEB生物工程公司）Vent_R—（exo^-）DNA聚合酶DDH₂O琼脂糖凝胶回收试剂盒PCR扩增仪（Biometra Personal PCR system,Germany）生物芯片点样仪（Micro GrindⅡ600,Biorobtics Ltd,England）激光共聚焦扫描仪(Gene TAC^TMLSⅣGenomic Solutions Inc.USA)空气变温PCR扩增仪和原位延伸基因芯片盒（实验室自制）二、实验方法1、应用生物信息学软件设计引物和HBV基因分型探针,并且分析其特异性。2、制备基因芯片:处理片基,按预先设计好的微阵列点阵使用生物芯片点样仪将探针点到芯片上,水化,烘烤固定并且与基因芯片盒组装备用。3、用酚-氯仿法提取HBV DNA模板。4、将样品进行扩增并测序。5、用核酸探针原位延伸基因芯片进行分型,并摸索出最优分型条件。6、重复芯片检测过程检测芯片的重复性,7、将基因芯片的分析结果与测序结果进行比较,验证基因芯片的准确性和可靠性。结果1、引物和探针序列设计合理,与其它病毒、细菌等无同源性,并且各基因型之间有很好的特异性。2、构建了新型的核酸探针原位延伸基因芯片。3、新型基因芯片的HBV基因型分析结果与测序结果一致,验证了基因芯片的可靠性。4、新型基因芯片的检测结果具有很好的重复性。结论1、引物和探针设计合理。2、构建的新型核酸探针原位延伸基因芯片可用于单碱基变异的检测。3、用新型的核酸探针原位延伸基因芯片对HBV的基因型进行了分析,证明该芯片具有很好的准确性和特异性。4、基因芯片的重复性实验表明该基因芯片具有很好的重复性。