腹腔感染是临床常见的一种疾病,其发病率逐年升高。日益增加的腹部交通事故伤、刀伤、创伤以及复杂的手术方式使得其伴随的腹腔感染更为严重。腹腔感染可导致肠上皮屏障破坏,肠道微生态紊乱,肠道免疫功能失衡,这三种改变构成肠源性细菌易位的三要素,进而引发全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)、脓毒症(sepsis)甚至多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)。目前,腹腔感染以及其所致脓毒症等的诊治仍然是困扰临床的一大难题。因此,对腹腔感染时这三要素的研究,可以帮助我们早期发现和干预因细菌易位导致的感染,对腹腔感染所致脓毒症的早期诊断以及提高腹腔感染的救治率有非常重要的作用。人体肠道中存在大量的细菌,它们不仅参与机体的营养代谢,还具有免疫调节、阻止病原体粘附等功能,从而组成机体的肠粘膜生物屏障。目前,越来越多的学者认识到了肠道微生态变化对于疾病发生发展的重要性,因此,关于肠道微生态紊乱与疾病发生机制的研究成为热点,新兴的分子生物学方法比如,变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、高通量测序等也为肠道微生态的研究提供了有力工具。本课题使用DGGE观察大鼠严重腹腔感染后不同时间点回肠和结肠菌群变化的特征,发现显著改变功能的细菌;通过观察腹腔感染后肠粘膜屏障功能改变,阐述菌群改变与肠粘膜屏障功能的相互关系。同时,我们应用DGGE方法检测感染后腹水、肝脏以及血液中细菌阳性率,并与细菌培养的方法比较,初步评估DGGE对脓毒症早期诊断的价值,为DGGE的临床推广应用提供实验依据。第一部分腹腔感染后大鼠肠道微生态变化特征研究研究一严重腹腔感染模型建立及感染后回肠菌群变化特征目的:建立严重腹腔感染动物模型,研究大鼠腹腔感染后不同时间点,回肠菌群结构改变规律,找到显著改变的功能细菌及其变化趋势。方法:选取90只SD大鼠随机分为6组。一组为假手术对照组(0小时组),其余为感染后3小时,6小时、12小时、24小时、48小时组。采用升结肠置管术(colon ascendens stent peritonitits,CASP)建立严重腹腔感染模型,观察各个时间点大鼠生存率,每个时间点选取6只存活大鼠,麻醉观察腹腔内感染情况。各组大鼠处死后分别取远端回肠粪便,提取总细菌DNA,扩增后进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)动态观察菌群结构变化,并使用Quantity One软件对凝胶条带进行相似性,多样性和主成分分析(PCA)分析,对显著改变的条带割胶测序,鉴定其细菌种属。结果:假手术对照组大鼠全部存活,造模后3h大鼠生存率为100%,麻醉开腹后腹腔内无明显病理改变;造模后6h大鼠生存率为87%,腹腔内有少量腹水产生,肠管无明显炎症改变;12h大鼠生存率为65%,肉眼可见腹腔内存在广泛炎症,肠管轻度水肿、出血;24h大鼠生存率为43%,腹腔感染严重,肠管存在轻度粘连,水肿出血更加严重;48h存活率为12%,腹腔广泛感染,肠管广泛水肿、粘连。对各组回肠粪便菌群DGGE分析显示,严重腹腔感染后,不同时间点回肠菌群组成不同。感染后6-48小时菌群结构与正常组菌群相比,差异随时间延长逐渐增大,48小时达到最大。菌种变化特征为:变形菌门细菌丰度持续升高:螺杆菌(Helicobacter cetorum)、巴氏杆菌(Pasteurella sp)、大肠杆菌(Escherichia sp)、未培养菌(Uncultured bacterium)、志贺菌(Shigella flexneri);硬壁菌门细菌感染后丰度持续降低:乳酸菌(Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus sp)、未培养硬壁菌(Uncultured Firmicutes bacterium);拟杆菌门细菌丰度先增多后减少:溃疡拟杆菌(Bacteroides helcogenes)、普雷沃氏菌(Prevotelladentalis)。菌群香农多样性指数和菌种数在感染24小时及以后与正常组相比显著增加(p<0.05)。结论:CASP可成功建立严重腹腔感染模型。腹腔感染以后,远端回肠菌群随感染时间延长,与正常菌群结构差异增大,感染48小时差异最大,菌群多样性明显增加。其中最特征性的改变是变形菌门细菌持续增多,硬壁菌门细菌持续减少。而拟杆菌门细菌在感染中期增多,感染晚期减少。研究二腹腔感染后结肠菌群变化特征目的:研究大鼠腹腔感染后不同时间点,结肠菌群结构改变规律,找到显著改变的功能细菌及其变化趋势方法:各组大鼠处死后分别取近端结肠粪便,提取总细菌DNA,扩增后进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)动态观察菌群结构变化,并使用Quantity One软件对凝胶条带进行相似性,多样性和主成分分析(PCA)分析,对显著改变的条带割胶测序,使用NCBI的BLAST工具与Nucleotide collection(nr/nt)数据库内基因比对,鉴定其细菌种属。结果:对各组结肠粪便菌群DGGE分析显示,严重腹腔感染后,不同时间点结肠菌群组成不同。感染后6小时菌群结构开始出现变化,至24和48小时菌群结构与正常组菌群相比差异最大。菌种变化特征为:大肠杆菌(Escherichia sp、Escherichia coli)和拟杆菌(Bacteroides coprosuis)感染后相对丰度持续增多;硬壁菌门细菌感染后丰度持续降低,主要有:乳酸菌(Lactobacillus gasseri、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus vaginalis)和未培养硬壁菌(Uncultured Firmicutes bacterium);普雷沃氏菌属细菌丰度先增多后减少,分别为:Prevotella dentalis、Prevotella sp。菌群香农多样性指数和菌种数在感染24小时及以后与正常组相比显著增加(p<0.05)。结论:腹腔感染以后,近端结肠菌群随感染时间延长,与正常菌群结构差异增大,感染24和48小时差异最大,菌群多样性明显增加。其中最特征性的改变是变形菌门和拟杆菌门细菌持续增多,硬壁菌门细菌持续减少。而普雷沃氏菌属细菌在感染中期增多,感染晚期减少。研究三腹腔感染对肠粘膜屏障功能影响目的:研究腹腔感染损伤后,肠道菌群紊乱,上皮屏障破坏二者发生的先后关系及严重程度,探讨肠道菌群紊乱对上皮屏障的影响。方法:上述时间点取远端回肠和近端结肠组织行病理学检查;电镜观察回结肠紧密连接超微结构的变化;免疫荧光检查回结肠上皮ZO-1蛋白表达。取血检测血清炎症因子白介素-1β(interleukin,IL-1β),IL-10 及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)水平。结果:腹腔感染6小时候回肠粘膜有轻微病理损伤,但Chiu’s评分与正常对照组无统计学差异。随着感染时间延长,回肠粘膜损伤愈发严重。感染24小时回肠粘膜损伤明显加重,Chiu’s评分与正常对照组存在统计学差异(p<0.001)。48h回肠粘膜损伤最为明显,Chiu’s评分明显高于正常对照组(p<0.001);结肠粘膜直至感染24小时才出现损伤,至48小时损伤最重,损伤评分明显高于对照组(p<0.001)。电镜观察回肠间紧密连接,发现感染后3h紧密连接已开始损伤,48h损伤最重,可见微绒毛消失,线粒体肿胀;结肠上皮感染24h出现损伤,48h损伤加重。激光共聚焦检测ZO-1蛋白可得到与电镜观察相似的结果;血清IL-1、TNF-α水平感染3h开始升高,24小时升高最为明显(p<0.001);血清IL-10水平感染12h开始上升,24h升至最高(p<0.001),然后开始下降。结论:腹腔感染3小时可出现回肠上皮屏障损伤,感染24小时结肠上皮屏障损伤。回肠粘膜上皮屏障功能的损伤早于菌群紊乱的发生,而结肠粘膜上皮屏障的损伤时刻则晚于菌群紊乱发生的时刻。第二部分DGGE对大鼠腹腔感染所致脓毒症的早期诊断研究一 应用DGGE对腹腔中细菌感染的早期诊断目的:通过常规培养与DGGE两种方法检测腹腔中细菌,探讨CASP后腹腔中细菌感染率,并比较两种方法对细菌感染检测的优劣。方法:各组大鼠相应时间点取腹水5ml,无腹水时用无菌生理盐水冲洗腹腔,收集冲洗液种于哥伦比亚血平板上,进行需氧和厌氧培养,如果有细菌生长则记为阳性;另各组取腹水200μl,提取细菌总DNA,行DGGE检测细菌阳性率。结果:造模成功3h腹水后可见细菌感染,培养阳性率为16.7%,DGGE检测阳性率为50%,两者无统计学差异;6h腹水细菌培养阳性率为33%,DGGE检测阳性率为83%,两者无统计学差异;12h腹水培养阳性率为50%,DGGE阳性率为100%,两者存在统计学差异(p<0.05);48h腹水培养阳性率和DGGE 阳性率都为100%;多重细菌感染阳性率:3h培养阳性率为16%,DGGE为33%;6h培养阳性率为33%,DGGE为83%,虽高于培养组,但无统计学差异;12小时培养阳性率为50%,DGGE为100%,两者存在统计学差异(p<0.05)。感染24h、48h培养阳性率分别为83%、100%,而DGGE都为100%。结论:造模后3小时腹腔中即可发现多重细菌感染,随病程延长,感染阳性率逐渐升高。DGGE检测腹腔中细菌感染阳性率明显高于传统细菌培养。研究二 应用DGGE对肝脏中细菌感染的诊断目的:通过常规培养与DGGE两种方法检测肝脏中细菌,明确腹腔感染后肝脏中细菌感染阳性率,进一步明确DGGE检测的优越性。方法:各组大鼠相应时间点无菌取肝脏组织200mg,使用生理盐水稀释,种于哥伦比亚血平板上,进行需氧和厌氧培养,如果有细菌生长则记为阳性。另各组取肝脏200mg,提取细菌总DNA,行DGGE检测细菌阳性率。结果:造模成功3h肝脏组织培养无细菌感染,而DGGE阳性率为33%;6h肝脏中细菌培养阳性率为33%,与DGGE检测阳性率持平;12h肝脏培养阳性率为33.3%,DGGE阳性率为50%,两者无统计学差异;24h肝脏培养阳性率为50%,DGGE阳性率为67%,两者无统计学差异;48h肝脏培养阳性率为50%,DGGE阳性率为100%,两者存在统计学差异(p<0.05)。多重细菌感染率:感染3小时和6小时肝脏中培养及DGGE检测都没发现多重细菌污染,阳性率为0;12小时培养阳性率为0,DGGE为33%;感染24h培养阳性率为33%,而DGGE为50%;48h培养阳性率为33%,DGGE阳性率为100%,明显高于培养组(p<0.05)。结论:造模后3小时DGGE即可发现肝脏中细菌感染,随病程延长,肝脏感染阳性率逐渐升高,而且可出现多重细菌感染。DGGE检测肝脏感染阳性率明显高于传统细菌培养。研究三 应用DGGE对血流感染的早期诊断目的:通过常规培养与DGGE两种方法检测血液中细菌感染,明确腹腔感染后血流感染阳性率,并比较血培养与DGGE两种检测方法的不同。方法:各组大鼠相应时间点无菌取血5ml,取100μ1种于哥伦比亚血平板上,进行需氧和厌氧培养,如果有细菌生长则记为阳性。另各组取血液200μ 1,提取细菌总DNA,行DGGE检测细菌阳性率。结果:造模成功3h血液中无细菌感染,培养阳性率和DGGE阳性率都为0;6h血液中细菌培养阳性率为0,DGGE检测阳性率为16%;12h血液细菌培养和DGGE阳性率都为16%;24h培养阳性率为16%,DGGE阳性率为50%,两者无统计学差异;48h血液培养阳性率为33%,DGGE阳性率为100%,两者存在统计学差异(p<0.05)。多重细菌感染率:感染3、6、12h血液中培养及DGGE检测都没发现多重细菌污染,阳性率为0;24小时培养阳性率为0,DGGE为50%,两者存在统计学差异(p<0.05);48h培养阳性率为16%,DGGE阳性率为50%,虽高于培养组,但无统计学差异。结论:腹腔感染后6小时血液中即可发现细菌存在,随病程延长,血流感染阳性率逐渐升高,而且可出现多重细菌感染。DGGE检测血流感染阳性率明显高于传统细菌培养,具有广阔的应用前景。