角膜新生血管相关的长链非编码RNA(lncRNAs)的鉴定及其调控机制研究

来源 :南京医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:caiyt
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目的:正常的角膜组织没有血管,周围血管终止于角膜缘,在角膜缘形成血管网,营养成分由此扩散入角膜。无血管化是角膜的主要特征,也是其完全透明,维持正常视力的重要因素。在炎症、感染、化学伤、变性等疾病中或由于眼科手术,维持角膜无血管的平衡因素被破坏,角膜会发生病理性新生血管,导致角膜丧失透明,从而最终影响视力,同时角膜新生血管(corneal neovascularization,CN)也是角膜移植手术发生排斥的高危因素。长链非编码RNA(lncRNAs)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,转录水平低于蛋白质编码基因,具有组织特异性。它们并不编码蛋白,而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控众多生物学过程。CN发病机制复杂,受到各个基因层面的调控,目前对lncRNAs在CN中的研究尚在起步阶段,有必要筛选和鉴定与CN有关的lncRNAs,阐明其作用机制,为CN的治疗提供新的药物靶点。本论文旨在建立小鼠的新生血管模型,鉴定小鼠新生血管角膜相关的lncRNAs,并研究其在CN发生发展中的潜在的调控机制。  方法:建立碱烧伤诱导的小鼠角膜新生血管模型,采用lncRNAs微阵列基因芯片技术分析lncRNAs在正常角膜和新生血管化角膜(CN)组织的表达谱,筛选差异表达的lncRNAs;根据Pearson相关性分析,构建lncRNAs/mRNA共表达网络;通过基因本体(GO)的富集分析和pathway分析等生物信息学技术,探讨lncRNAs/mRNA共表达基因在角膜新生血管发生的作用机制及可能的病理途经;根据芯片检测结果,筛选了20个差异表达显著的lncRNAs,对两组角膜样本用RealTime PCR验证芯片检测结果,同时检测了抗血管生成因子(PDGF和endostadin)和促血管生成因子(VEGF及iNOS)的表达,分析这些相关的lncRNAs的表达规律。分别选取差异表达最显著的上调、下调lncRNAs作为研究靶点,临床采集角膜炎、化学伤、外伤患者的角膜样本,采用RealTime-PCR,对筛选出的角膜新生血管相关的靶点lncRNAs进行表达分析验证,同时检测样本促血管生长因子(VEGF,Ang-2,MMP-9)和抗血管生长因子(PDGF)的表达,并与上述两条靶点lncRNAs的表达趋势进行比较,分析这两条相关lncRNAs的表达规律。利用人脐静脉内皮细胞株(HUVEC),通过设置空白对照组、h2o2组、H2O2+Scr siRNA组和H2O2+NR-033585siRNA组,分别进行Hoechst33342染色、JC-1染色、PI染色和Ki67检测,判断在氧化应激状态下,人同源lncRNAs NR_033585对(HUVEC)活力、增殖的影响,在分子水平探讨其潜在的调控机制。  结果:动物模型中,通过lncRNAs基因芯片技术,分析CN组和正常组样品的lncRNAs表达谱,筛选差异有统计学意义(P<0.05)并且变化倍数在3.0倍以上的lncRNAs,共计154条,其中下调的共60条,上调的共94条。GO分析是根据基因本体论,将基因分成三类:生物学进程类,细胞组分类,分子功能类。实验发现,高富集lncRMAs/mRNA共表达基因,在细胞外区(本体:细胞组分类),DNA结合(本体论:分子功能类),和免疫反应(本体论:生物学进程类)。GO富集分析提示CN的生物学行为发生在细胞外区,与DNA结合并发生免疫反应。KEGG数据库分析结果显示lncRNAs潜在的靶基因mRNA可能参与多个信号通路,如癌症信号通路,MAPK信号通路,钙信号通路,神经活性的配体受体相互作用,缝隙连接,Toll样受体信号通路和Wnt信号通路。通路分析表明“癌症通路”基因富集度最高,提示CN的信号通路与癌症的信号通路有一定的相似性。对筛选出的20条差异表达显著的lncRNAs,qRT-PCR验证其中17条的表达水平与芯片检测结果相一致,上调的lncRNAs与促血管生长因子(VEGF及iNOS)的表达趋势一致,下调的lncRNAs与抗血管生长因子(PDGF,endostadin)的表达趋势一致。临床采集角膜炎、化学伤、外伤患者角膜样本,分别选取差异表达最显著的上调、下调lncRNAs作为研究靶点(上调最显著:人同源NR033585;下调最显著:人同源chr8:129102060-129109035A反链),对上述临床采集的角膜样本进行Real Time-PCR检测,对筛选出的角膜新生血管相关的靶点lncRNAs进行表达分析验证,同时检测样本促血管生长因子(VEGF,Ang-2,MMP-9)和抗血管生长因子(PDGF)的表达,并与上述两条靶点lncRNAs的表达趋势进行比较,分析这两条相关lncRNAs的表达规律。在细胞水平,在氧化应激情况下,下调人类同源NR033585的表达可明显促进HUVEC的凋亡,影响其增殖活性。  结论:动物造模鉴定出与CN相关的lncRMAs,临床样本进行验证及分析其表达模式,并在细胞水平研究其调控机制。对CN的发病机制提出了新的观点,对失调的lncRNAs进行干预可能对角膜血管疾病的预防和治疗有一定的帮助。
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