第一部分肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌细胞对吉西他滨化疗抵抗目的:诱导建立肿瘤相关巨噬细胞模型并鉴定表型,检测肿瘤相关巨噬细胞对胆管癌细胞化疗耐药的影响,验证其对胆管癌细胞凋亡过程的调节。方法:综合文献经典方案用细胞因子诱导人单核细胞THP-1,使其分化为肿瘤相关巨噬细胞(TAM),并通过流式细胞数及RT-PCR验证相应标志物表达。CCK8、流式及WB用以检测TAM诱导的胆管癌细胞对吉西他滨化疗耐药,验证其对于细胞凋亡的影响。结果:所有巨噬细胞分型CD11b均高表达,其中M1型CD80与IL12高表达,而M2型CD206与IL10高表达。CCK8结果显示显示TAM条件培养基(CM)显着降低胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性;流式细胞学证明药物抗性是通过减少吉西他滨诱导的细胞凋亡来介导的;WB显示在TAM-CM孵育时吉西他滨诱导胆管癌细胞的活化caspase-3表达显著减少。结论:肿瘤相关巨噬细胞模型建立成功,其通过减少吉西他滨诱导的胆管癌细胞凋亡来介导化疗抵抗。第二部分a PKCι/NF-κB信号通路介导肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌细胞耐药目的:探讨a PKCι介导肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌细胞耐药的机制。方法:建立稳定过表达和低表达a PKCι的人胆管癌细胞系,WB检测a PKCι过表达或低表达的人胆管癌细胞中磷酸化NF-κB、P62以及核蛋白中NF-κB表达情况,并通过双荧光素酶报告基因系统验证NF-κB活化情况;锚定非依赖实验检测上述细胞转化生长能力并验证NF-κB抑制剂(PDTC)对于a PKCι介导的转化生长的影响。WB检测TAM-CM诱导的吉西他滨耐药的细胞中a PKCι、NF-κB的活化情况以探索诱导耐药的信号通路。WB及双荧光素酶报告基因系统检测P62是否参与a PKCι/NF-κB信号通路。氨基酸点突变技术及IP实验验证a PKCι通过P62调控NF-κB的机制。结果:在体外,上调人胆管癌细胞a PKCι表达,P-a PKCι、P-NF-κB以及入核NF-κB表达明显增多,同时双荧光素酶报告基因系统也证实NF-κB活化增强,反之下调a PKCι表达时上述分子表达则相应减少;a PKCι过表达时胆管癌细胞转化生长能力增强,而NF-κB抑制剂(PDTC)则逆转此现象;TAM-CM诱导的吉西他滨耐药的细胞中a PKCι、NF-κB的活化均较空白和对照组增强;靶向沉默人胆管癌细胞中P62的表达,NF-κB活化程度降低;PB1结构域点突变后,a PKCι与P62结合被抑制。结论:在体外a PKCι通过调控NF-κB入核活化促进胆管癌细胞转化生长;肿瘤相关巨噬细胞诱导通过a PKCι/NF-κB信号通路诱导胆管癌细胞耐药;a PKCι与P62通过PB1结构域相互结合并作用,促进NF-κB活化。第三部分a PKCι/NF-κB信号通路介导肿瘤相关巨噬细胞诱导的胆管癌细胞上皮间质转化目的:在第二部分实验提示a PKCι/NF-κB信号通路参与肿瘤相关巨噬细胞对胆管癌细胞作用的基础上,进一步探讨a PKCι/NF-κB信号通路介导肿瘤相关巨噬细胞诱导的胆管癌细胞上皮间质转化。方法:荧光素酶报告基因系统检测用TGFβ1处理胆管癌细胞以及添加TGFβ1受体抑制剂或TGFβ1中和抗体处理后的NF-κB活性变化;用WB检测在不同时间梯度下TGFβ1处理a PKCι表达不同的胆管癌细胞中a PKCι/NF-κB信号通路活化情况;共聚焦验证TGFβ1是否促进NF-κB入核;RT-PCR及ELISA检测TAM中TGFβ1的表达;WB检测a PKCι表达不同的胆管癌细胞在TAM-CM培养下a PKCι/NF-κB信号通路活化情况,并用对应的抑制剂或si RNA验证TGFβ1、a PKCι及NF-κB在其中的关键作用;细胞形态学、免疫荧光及WB检测TAMCM诱导的胆管癌细胞EMT表型及标志物变化,并通过相应抑制剂及中和抗体验证TGFβ1及NF-κB在其中的关键作用;划痕及侵袭实验体外验证TAMCM诱导的胆管癌细胞EMT的体外效应。在体内,使用BALB/c裸鼠建立皮下成瘤和肺转移模型,检测肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌生长和转移变化,验证a PKCι在其中扮演角色,并用免疫组化检测P-a PKCι及F4/80(巨噬细胞)表达。结果:TGFβ1能够诱导NF-κB活化,并可被TGFβ1中和抗体及其受体抑制剂抑制;随着TGFβ1处理时间增加,胆管癌细胞a PKCι/NF-κB活化不断增强,并在处理3-5h间达到顶峰,而a PKCι低表达时,所有效应均减弱;共聚焦扫描显示TGFβ1促进NF-κB入核,且该效应可被a PKCι-si RNA及NF-κB抑制剂PDTC所抑制;RT-PCR及ELISA检测TAM中TGFβ1的表达相对于其他表型巨噬细胞明显增多;在TAM-CM培养下胆管癌细胞中P-a PKCι、P-NF-κB表达增多,而当a PKCι过表达时P-a PKCι、P-NF-κB表达明显增强,该效应在PDTC处理及TGFβ1抑制时被逆转;在TAM-CM培养下胆管癌细胞形态变长梭形,免疫荧光及WB显示上皮标志物E-cad表达减少、间质标志物Vimentin表达增多,而以上效应在PDTC处理及TGFβ1抑制时可被逆转;胆管癌细胞在TAM-CM孵育下侵袭能力、迁移能力和增殖能力增强,而此效应在PDTC处理及TGFβ1抑制时可被逆转;在体内实验中,当巨噬细胞清除时,形成皮下肿瘤的体积明显减小,形成肺转移结节的数目也减少;免疫组化结果显示P-a PKCι在皮下肿瘤和肺转移结节中的表达随着巨噬细胞清除而减少。结论:在胆管癌细胞中,a PKCι介导TGFβ1诱导NF-κB活化;TAM分泌TGFβ1通过a PKCι/NF-κB信号通路诱导胆管癌细胞上皮间质转化,并促进肿瘤体内生长和转移。第四部分a PKCι介导的胆管癌间质表型细胞分泌CCL5招募并诱导巨噬细胞M2型极化目的:进一步探索两种细胞间的相互作用关系,探讨a PKCι介导的胆管癌间质表型细胞招募巨噬细胞形成正反馈环路的分子机制。方法:定量检测抗体(Raybio)芯片技术分析稳定高表达a PKCιi胆管癌细胞与正常细胞相比,培养液上清中的差异性免疫因子;RT-PCR及ELISA检测间充质样胆管癌细胞中的CCL5表达,并验证PDTC对于CCL5表达的影响;构建野生型和突变型CCL5启动子荧光素酶报告质粒,瞬时转染分析胆管癌细胞在TGFβ1和/或TNFa处理时的相对荧光强度;流式细胞学及RT-PCR检测孵育在间充质样胆管癌细胞条件培养基中或CCL5处理的THP-1,验证其巨噬细胞分型,并检测在添加PDTC或CCL5中和抗体处理后的分型变化;WB检测上述处理巨噬细胞中经典信号通路的变化;a PKCι介导的间充质样胆管癌细胞与THP-1细胞共培育以检测其对巨噬细胞的趋化作用,并用a PKCι-si RNA、PDTC及CCL5中和抗体处理后检测a PKCι、NF-κB及CCL5在招募巨噬细胞中的作用;用稳定过表达a PKCι的人胆管癌细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,口饲给予CCL5受体抑制剂Maraviroc,检测皮下成瘤大小,并免疫组化检测巨噬细胞招募情况。结果:a PKCι介导的胆管癌间质表型细胞高表达并分泌CCL5,PDTC能够减少CCL5表达;TGFβ1与TNFa均能增强荧光素酶实验中的相对荧光,而TGFβ1在TNFa刺激基础上能进一步增强荧光强度;用间充质样胆管癌细胞条件培养基孵育后,巨噬细胞以表达CD206与TGFβ1为主,WB显示巨噬细胞STAT3的磷酸化水平显着增加,而PDTC或抗CCL5处理则消除了上述效应;与THP-1共培养显示间充质样胆管癌细胞对巨噬细胞具有明显的招募作用,而a PKCι-si RNA、PDTC及CCL5中和抗体消除了这种作用。在体内,稳定过表达a PKCι人胆管癌细胞系构建的裸鼠成瘤模型中,CCL5受体抑制时移植瘤体积减小;IHC实验发现体内CCL5受体被抑制时肿瘤中招募巨噬细胞减少,P-a PKCι表达降低。结论:a PKCι通过NF-κB信号通路调节胆管癌EMT并诱导CCL5分泌;a PKCι介导的胆管癌间质表型细胞通过分泌CCL5招募并诱导巨噬细胞M2型极化;体内实验结合前期结果证实TAM与胆管癌细胞间形成正向环路促进肿瘤进展。第五部分纳米脂质体联合输运a PKCι-si RNA和吉西他滨对胆管癌治疗疗效研究目的:设计并制备共递送脂质体系统联合运输a PKCι-si RNA和吉西他滨,初步探讨两者在胆管癌中的协同抗肿瘤效应。方法:与同济医学院药学院合作,用薄膜分散水合方法合成Gemcitabine-L,带正电荷的脂质体通过静电相互作用按比例吸附带负电荷的a PKCι-si RNA形成Gemcitabine/a PKCι-si RNA-L,并使用Zeta PALS测定物理化学表征;锚定非依赖实验检测相应药物对胆管癌转化生长的影响;体内构建裸鼠皮下移植瘤模型,定期注射不同制剂,检测各种制剂的抗肿瘤作用;免疫组化验证Gemcitabine/a PKCι-si RNA-L对于a PKCι/NF-κB通路以及对TAM的影响。结果:成功制备共递送脂质体系统,体外实验证实Gemcitabine/a PKCι-si RNA-L相较于其他制剂明显抑制胆管癌转化生长;体内裸鼠成瘤模型中,共递送脂质体组相较于单药和单递送脂质体组明显抑制皮下移植瘤体积;免疫组化显示吉西他滨可诱导NF-κB活化及巨噬细胞聚集,而联合a PKCι-si RNA治疗则减弱上述效应。结论:纳米脂质体联合输运a PKCι-si RNA和吉西他滨具有良好的协同抗肿瘤作用,靶向a PKCι可抑制肿瘤生长并增强吉西他滨化疗敏感性。