研究背景研究表明脑缺血／再灌注损伤引起的神经细胞死亡通过凋亡和坏死两条途径。延迟性的细胞死亡既凋亡是脑缺血／再灌注后神经元死亡的重要方式。脑缺血／再灌注后神经元凋亡的发生机制与凋亡相关基因被激活、被调控后细胞凋亡信号转导通路被启动有关。阐明脑缺血／再灌注后神经元发生凋亡的机制以及寻找药物有效的阻断脑缺血／再灌注后凋亡的发生、发展是一项迫切而有意义的工作。在正常条件下脑内血红素氧合酶-1（H0-1）很难被检测到。脑内H0-1在多种因素（如重金属、热休克、紫外线、内毒素、缺血／再灌注、缺氧、高氧、一氧化氮供体、过氧亚硝基、血红素和血红蛋白等）的诱导下被激活，是目前已知脑内最易受诱导的酶。这些诱因通常导致脑发生氧化应激反应，提示H0-1是脑细胞对抗氧化应激反应的重要组成部分。基因疗法中H0-1基因在对抗缺血／再灌注损伤等方面亦取得很好效果。另有研究表明被激活的H0-1可能参与其他基因表达的调节，提示H0-1起着信号转导分子的作用；而且最近还有研究发现H0-1对器官缺血／再灌注损伤的保护作用与其影响某些凋亡因子有关。但目前对诱导和调节H0-1基因表达的信号转导通路以及H0-1被激活后参与调节其他基因表达的机制仍不清楚。研究证明吸入麻醉药具有抗脑缺血／再罐注损伤的作用。公认吸入麻醉药脑保护的机制与降低缺血后脑组织的代谢和扩张脑血管、抑制自由基的合成和脂质过氧化反应、以及对神经递质的调控等因素有关。最近有研究发现吸入麻醉药能够诱导大鼠肝细胞H0-1基因表达，该研究结果提示吸入麻醉药也是H0-1基因表达的诱导剂。但吸入麻醉药是否也能够诱导神经元H0-1表达?吸入麻醉药脑保护作用是否与吸入麻醉药诱导神经元H0-1表达有关?目前还没有研究来证实这些问题。最近的研究发现吸入麻醉药脑保护作用还与影响细胞凋亡有关。但吸入麻醉药对细胞凋亡的影响是否通过影响H0-1从而影响细胞凋亡还尚无此方面的研究。因此，证明吸入麻醉药脑保护作用与吸入麻醉药激活H0-1有关是本研究的目的，研究结果将进一步丰富吸入麻醉药脑保护的理论。基于上述原因，本研究建立了模拟机体脑缺血／再灌注损伤的原代培养大鼠海马神经元氧糖剥夺模型，选择近年开始应用于临床的吸入麻醉药七氟醚对氧糖剥夺的神经元进行干预。在此基础上，观察七氟醚对氧糖剥夺的神经元进行干预后神经元H0-1-mRNA的变化及神经元凋亡的情况，研究七氟醚保护作用与H0-1之间的联系；观察七氟醚对氧糖剥夺的神经元进行干预后PI₃-K／Akt／P^70s6k信号通路和H0-1的变化，研究七氟醚诱导H0-1-mRNA表达的信号通路；观察七氟醚对氧糖剥夺的神经元进行干预后H0-1和Fas的变化，研究七氟醚诱导的H0-1表达抑制神经元凋亡的机制。材料与方法一、实验材料新生（出生48小时内）Wistar大鼠70只，由中国医科大学实验动物中心提供。CO₂培养箱（HERA CELL 150，德国）；缺氧箱（Biotech，英国）；倒置显微镜（Olympus，日本）；Ohmeda麻醉机（Excel 210，美国）；PCR扩增仪（Biometra，德国）；酶标仪（Tecan，英国）；Scion Image图像处理与分析软件（Apple，美国）；凝胶成像分析系统（Kodak 2D，德国）；Olympus AX-70显微摄像系统（Olympus，日本）；紫外分光光度仪（UV 1201，日本）；DYY-6B电泳仪（北京市六一仪表厂）；RT-PCR试剂盒（TaKaRa，日本）；TUNEL试剂盒、即用型SABC免疫组化试剂盒、Western blot检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；96孔和6孔无菌培养板（Biofil，加拿大）；高糖型（4.5g／L）DMEM培养液（Hyclone，美国），无糖、无氧DMEM液（Hyclone，美国），F12培养液（Hyclone，美国），胎牛血清（FBS，Hyclone，美国），马血清（HS，Hyclone，美国），0.25％胰蛋白酶（Hyclone，美国），青链霉素混合液（Hyclone，美国）；磷酸化PI₃-K-P110α、Akt、P^70S6K、Fas和H0-1抗体（Calbiochem，英国），NSE抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；LY294002、Triciribin、Rapamycin（Biomol，美国），七氟醚（丸石制药株式会社，日本）；噻唑蓝、二甲基亚砜、Zinc-protoporphyrin（Sigma-Aldrich，美国）；阿糖胞苷（上海华联制药厂）。二、实验方法（一）实验一将培养7d的海马神经元随机分为5组（n=10）：正常培养组（C1组），按正常培养方法培养；氧糖剥夺组（D组），进行缺糖缺氧后复糖复氧处理；正常培养+2％七氟醚组（C2组），正常培养神经元接受2％七氟醚麻醉；氧糖剥夺+2％七氟醚组（S组），神经元缺糖缺氧的同时接受2％七氟醚麻醉，然后复糖复氧处理；氧糖剥夺+2％七氟醚+Znpp组（H0-1抑制剂，Z组），神经元进行缺糖同时加入Znpp使其终浓度为10μmmol·L^-1后同S组处理。处理结束后正常培养24h后收集处理细胞，MTT法检测神经元存活率，TUNEL检测神经元凋亡率，RT-PCR检测H0-1-mRNA的表达，Western-blot检测H0-1蛋白的表达。（二）实验二将培养7d的海马神经元随机分为6组（n=10）：正常培养组（C组），按正常培养方法培养；氧糖剥夺组（D组），进行缺糖缺氧后复糖复氧处理；氧糖剥夺+2％七氟醚组（S组），神经元缺糖缺氧的同时接受2％七氟醚麻醉，然后复糖复氧处理；氧糖剥夺+2％七氟醚+LY294002组（PI₃-K抑制剂，L组），神经元进行缺糖同时加入LY294002使其终浓度为10μmmol·L^-1后同S组处理；氧糖剥夺+2％七氟醚+Triciribin组（Akt抑制剂，T组），神经元进行缺糖同时加入Triciribin使其终浓度为10μmmol·L^-1后同S组处理；氧糖剥夺+2％七氟醚+Rapamycin组(P^70S6K抑制剂，R组)，神经元进行缺糖同时加入Rapamycin使其终浓度为10nmmol·L^-1后同S组处理。处理结束后正常培养24h后收集处理细胞，MTT法检测神经元存活率，TUNEL检测神经元凋亡率，RT-PCR检测H0-1-mRNA的表达，Western-blot检测PI₃-K、Akt和P^70S6K蛋白表达。（三）实验三将培养7d的海马神经元随机分为5组（n=10）：正常培养组（C组），按正常培养方法培养；氧糖剥夺组（D组），进行缺糖缺氧后复糖复氧处理；氧糖剥夺+2％七氟醚组（S1组），神经元缺糖缺氧的同时接受2％七氟醚麻醉，然后复糖复氧处理；氧糖剥夺+4％七氟醚组（S2组），神经元缺糖缺氧的同时接受4％七氟醚麻醉，然后复糖复氧处理；氧糖剥夺+4％七氟醚+Znpp组（Z组），神经元进行缺糖同时加入Znpp使其终浓度为10μmmol·L^-1后同S2组处理。处理结束后正常培养24h后收集处理细胞，MTT法检测神经元存活率，TUNEL检测神经元凋亡率，RT-PCR检测H0-1-mRNA的表达，Western-blot检测Fas蛋白的表达。结果一、实验一与C1组比较C2组海马神经元H0-1-mRNA和H0-1蛋白表达增加（P＜0.05）。与D组比较S组海马神经元H0-1-mRNA的表达增加，H0-1蛋白表达增加，神经元存活率增加、凋亡率降低（P＜0.05）。与S组比较Z组海马神经元H0-1-mRNA的表达减少，H0-1蛋白表达减少，神经元存活率降低、凋亡率增加（P＜0.05）。二、实验二与D组比较S组海马神经元PI₃-K、Akt和P^70S6K蛋白表达增加，H0-1-mRNA的表达增加，神经元存活率增加、凋亡率降低（P＜0.05）。与S组比较L组海马神经元PI₃-K、Akt和P^70S6K蛋白表达减少，H0-1-mRNA的表达减少，神经元存活率降低、凋亡率增加（P＜0.05）。与S组比较T组海马神经元Akt和P^70S6K蛋白表达减少，H0-1-mRNA的表达减少，神经元存活率降低、凋亡率增加（P＜0.05）；PI₃-K蛋白表达变化无统计学意义（P＞0.05）。与S组比较R组海马神经元P^70S6K蛋白表达减少，H0-1-mRNA的表达减少，神经元存活率降低、凋亡率增加（P＜0.05）；PI₃-K和Akt蛋白表达变化无统计学意义（P＞0.05）。三、实验三与D组比较S1组海马神经元H0-1-mRNA的表达增加，Fas蛋白表达减少，神经元存活率增加、凋亡率降低（P＜0.05）。与S1组比较S2组海马神经元H0-1-mRNA的表达增加，Fas蛋白表达减少，神经元存活率增加、凋亡率降低（P＜0.05）。与S2组比较Z组海马神经元H0-1-mRNA的表达减少，Fas蛋白表达增加，神经元存活率降低、凋亡率增加（P＜0.05）。结论一、七氟醚能够诱导原代培养大鼠海马神经元H0-1-mRNA的表达。二、七氟醚通过诱导氧糖剥夺神经元H0-1-mRNA的表达，从而抑制神经元的凋亡。三、七氟醚通过PI₃-K／Akt／P^70S6K细胞信号转导通路诱导氧糖剥夺神经元H0-1-mRNA的表达而抑制神经元的凋亡。四、七氟醚诱导的H0-1-mRNA表达抑制了凋亡因子Fas，从而抑制了氧糖剥夺神经元的凋亡。