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一、研究背景:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是严重危害人类健康的重大疾病之一,其发病率及死亡率均呈逐年上升趋势。肿瘤干细胞是肿瘤发生发展及复发的根本原因。自我更新是肿瘤“干性”的基本特征,导致肿瘤无限增殖及复发转移。研究表明,阻断肿瘤干细胞的自我更新能力是肿瘤靶向治疗的有效途径,但目前肿瘤干细胞自我更新调控机制仍不清楚。表观修饰（甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等）对蛋白活性功能发挥重要作用。研究表明多种抑癌基因及癌基因的甲基化修饰与其抑癌或促癌活性密切相关,参与调控肿瘤“干性”表型,但其受何种机制调控尚不明确。深入研究癌基因或抑癌基因表观修饰的调控机制及其对肿瘤干细胞自我更新的影响,可进一步阐释肿瘤发生发展的分子机制,对肿瘤靶向药物研发具有重要意义。目前代谢基因的异常激活或失活成为恶性肿瘤的重要标志。课题组成员前期研究成功鉴定出一个新的脂代谢相关抑癌基因,含自水解酶域蛋白5,又称Abhd5（Abhydrolase domain containing 5,Abhd5）,其表达缺失可显著促进结肠癌发生发展,但其具体分子机制仍不清楚。Abhd5是体内甘油三酯分解过程中的重要辅助因子,其本身虽没有脂肪酶的活性,但它可通过激活其他甘油三酯脂肪酶参与调控非脂肪组织和脂肪组织中的脂肪分解过程。本研究发现Abhd5的缺失促进Wnt信号通路的激活,以非β-Catenin依赖性方式增加并维持结肠癌细胞的“干性”,推测Abhd5介导的结肠癌细胞自我更新能力的改变是促进结肠癌发生发展的重要原因,深入探索Abhd5与DPY30相互作用影响组蛋白甲基转移酶SET1A活性进而维持结肠癌“干性”的分子机制,进一步阐明了该基因发挥抑癌基因的作用的分子途径。90%的结肠癌和所有家族性腺瘤息肉病都与Wnt信号通路的过度激活相关,然而在结肠癌中单纯阻断Wnt信号通路的策略并无显著效果,因此揭示新的靶基因,特别是调节Wnt/β-Catenin信号通路的基因,将在临床肿瘤的诊断和治疗中具有重要的意义和价值。近年来大量研究证实了发育相关基因参与调控Wnt信号通路并促进结肠癌发生发展。本研究发现发育相关基因,同源盒基因A13（Homeobox A13,HOXA13）,在结肠癌中显著上调,并且其基因高表达显著促进结肠癌细胞的增殖。为进一步明确HOXA13在结肠癌中的促癌作用,利用慢病毒载体技术建立HOXA13敲低及过表达结肠癌细胞模型,深入探索HOXA13在调控Wnt信号通路促进结肠癌发生发展的具体分子机制。二、研究目的1.明确Abhd5通过与DPY30相互作用影响SET1A活性,进而调控重要癌基因YAP甲基化激活的分子途径,揭示Abhd5在表观遗传调控中的新功能。2.进一步阐明Abhd5发挥抑癌基因作用的分子途径,为结肠癌临床治疗提供新的靶标。3.探索HOXA13在结肠癌恶性增殖中的作用及分子机制。三、材料与方法1.利用慢病毒载体技术建立Abhd5敲低的HCT-116结肠癌细胞模型,基因敲除技术构建Abhd5肠道特异性敲除APCmin/+小鼠,结合TCGA数据库分析、干细胞成球实验、软琼脂克隆形成实验、流式细胞学技术、无限稀释成瘤实验、腺相关病毒尾静脉注射等方法,验证Abhd5缺失激活YAP信号对结肠癌“干性”的影响。2.利用人结肠癌细胞HCT-116为模型,结合质谱分析、免疫组化、免疫荧光染色、Western Blot、Co-IP、Chip等实验方法,阐明Abhd5调控YAP翻译后修饰对YAP细胞定位及活性的影响。3.基于慢病毒载体构建Abhd5高低表达的结肠癌细胞系,结合荧光素酶报告基因实验、免疫荧光、Co-IP等实验技术探索Abhd5调控SET1A对YAP细胞定位的修饰的影响。4.利用核浆分离实验、质谱检测、IP等实验阐明Abhd5调控DPY30核转位影响SET1A活性的分子机制。5.利用结肠癌组织芯片的免疫组织化学染色检测HOXA13在结肠癌及癌旁组织的表达和临床相关性。6.慢病毒载体技术构建HOXA13基因敲低和过表达的人结肠癌细胞系用于体外增殖能力检测及机制研究。四、研究结果1.Abhd5缺失增加CD133+/CD44+及ALDH+细胞比例,显著促进结肠癌细胞的“干性”,结肠癌细胞敲低Abhd5表达后,调控干细胞自我更新能力的Wnt通路靶基因Met表达升高,且在Abhd5敲低的结肠癌细胞中进一步敲低Met表达可显著逆转细胞自我更新能力。进一步研究发现,Abhd5缺失激活Wnt通路靶基因Met并非通过经典β-Catenin依赖的途径,β-Catenin的表达活性在Abhd5缺失的结肠癌细胞中无显著变化。继续探索发现在Abhd5敲低的细胞中,YAP信号途径被激活,YAP核定位增加,促进Met的转录表达。2.Abhd5缺失促进SET1A介导的YAP K342甲基化,进而促进YAP核定位及活性。在Abhd5敲低的结肠癌细胞中,YAP在K342位点的甲基化水平显著升高,且这种YAP的甲基化依赖于组蛋白甲基转移酶SET1A的活性。3.Abhd5缺失显著上调SET1A复合物核心亚基DPY30的表达及核转位,且进一步研究发现Abhd5在胞浆中与DPY30发生相互结合而促进DPY30泛素化降解。4.以Abhd5lowDPY30highMethigh为特征的结肠癌患者可从Met抑制剂沃利替尼（Savolitinib）中获益。5.人结肠癌组织中HOXA13的表达较正常组织高,且HOXA13在癌组织中的高表达与临床预后不良密切相关。6.基于慢病毒载体构建HOXA13敲低和过表达的人结肠癌细胞系,使用克隆形成、CCK-8实验和裸鼠移植瘤实验发现HOXA13高表达促进结肠癌细胞的恶性增殖。7.HOXA13通过β-Catenin依赖的Wnt信号通路促进结肠癌的恶性增殖。进一步研究发现Wnt信号通路在HOXA13高表达的结肠癌中显著富集,且HOXA13过表达的结肠癌细胞中β-Catenin的活性明显增加,HOXA13与β-Catenin结合,HOXA13的过表达导致Wnt/β-Catenin通路下游靶基因Cyclin D1、Met的表达升高。五、结论1.Abhd5缺失通过非β-Catenin依赖的途径激活Wnt信号通路靶基因Met,进而促进结肠癌自我更新能力;2.Abhd5缺失抑制DPY30泛素化降解而促进DPY30入核激活甲基化酶SET1A,进而诱导YAP K342位点甲基化及核定位而持续激活下游基因Met的表达,导致结肠癌细胞“干性”而促进结肠癌恶性进展;3.HOXA13在人结肠癌组织中高表达,其高表达与临床预后不良相关;4.HOXA13与β-Catenin结合并促进β-Catenin的核积累,从而导致Wnt通路靶基因Cyclin D1、Met上调,Wnt/β-Catenin信号通路的活性增强,进而促进结肠癌细胞的恶性增殖。