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由于在过去的六十年中氯乙酰胺类除草剂的大量使用,微生物已经进化出矿化这些化合物的途径。在氯乙酰胺类除草剂微生物代谢的上游途径中,通过N-脱烷基和酰胺水解转化为两种常见的代谢产物2-甲基-6-乙基-苯胺(MEA)和2,6-二乙基苯胺(DEA)。下游途径中MEA代谢是由芳香环羟基化起始,经过几步转化成为开环底物。整个途径中大多数的上游基因已经被确定,而负责MEA初始羟基化及开环的基因却还未报道,对此我们展开了以下研究:1.MEA代谢突变菌株的获得及其代谢途径分析本研究以能完全矿化MEA的菌株Sphingobium baderi DE-13为出发菌株,通过连续传代获得两株代谢MEA的突变菌株DE-13-D2和DE-13-E9。其中菌株DE-13-D2失去了完全矿化MEA的能力,能转化MEA并积累中间物质,而菌株DE-13-E9则完全失去MEA降解能力。利用HPLC-MS/MS的方法对突变菌株DE-13-D2代谢MEA所积累的中间物进行鉴定,经MS/MS分析鉴定出:4-羟基-2-甲基-6-乙基苯胺(4-OH-MEA),2,6-甲乙基对苯醌亚胺(MEBQI),2,6-甲乙基对苯二酚(MEHQ)。因此推测MEA的降解的起始步骤是在对位加羟基形成4-OH-MEA。2.基于比较基因组分析预测MEA降解基因为了找到MEA代谢突变菌株中丢失的基因,通过基因组测序获得了野生菌株DE-13的基因组完成图和两株突变菌株DE-13-D2、DE-13-E9的基因组草图。野生菌株DE-13的基因组完成图大小为4.58Mb,包括一个环状染色体和八个质粒。突变菌株DE-13-E9的基因组包含159个contigs,大小为4.48Mb。突变菌株DE-13-D2的基因组包含84个contigs,大小为4.42Mb。基因组相互比较结果显示,与野生型相比,突变菌株DE-13-E9丢失了一段长度约14-Kb碱基的片段,命名为F-E9,突变菌株DE-13-D2丢失了一段长度约44.6-Kb碱基的片段,命名为F-D2。预测参与MEA起始降解的基因在片段F-E9中,此片段含有13个ORF(>500bp),其中有一个基因meaX与编码双组分黄素蛋白单加氧酶系统的氧化酶组分的基因具有同源性。MeaX由406个氨基酸组成,与来自红球菌属的菌株RHA1的HsaA和来自鞘脂菌属的菌株MEA3-1的MeaA分别具有27%和24.8%的氨基酸序列相似性。3.MeaXY的遗传回补和异源表达及酶学实验分别将包含meaX、orf4、meaXorf4基因的片段克隆连接到广宿主载体pBBR1MCS2上,过三亲接合的方式转入MEA代谢突变菌株DE-13-E9中,质粒pBmeaXorf4和pBmeaX都可以使菌株DE-13-E9恢复MEA的降解能力。分别将meaX、orf4、meaY基因连接到表达载体上,并导入E.coli BL21中进行诱导表达及亲和层析纯化。MeaXY是一个双组分黄素蛋白单加氧酶系统,其使用NADH和FMN为辅因子催化MEA和DEA的羟基化。MeaXY对MEA/DEA的Km值分别为 0.43±0.053 μM,0.53±0.024μ,相应的kcat/Km值分别为 1.72±0.084s-1·μM-1,1.49±0.12s-1· μM-1。硅胶柱层析分离MeaXY催化MEA和DEA的产物并进行1HNMR鉴定,确定MEA/DEA的苯环羟基化是发生在对位。4.下游芳环开环基因的初步研究3-OH-MEHQ是下游芳环开环的底物,该底物与1,2,4-苯三酚在结构上比较类似,因此推测两者的开环途径也比较相似,都是以1,2,4-苯三酚1,2双加氧途径开环。分析野生菌株DE-13的完成图中注释的双加氧酶基因,从中克隆出一个编码1,2,4-苯三酚1,2双加氧酶的基因meaC。通过E.coli BL21异源表达和纯化后蛋白电泳显示MeaC大小大约为34KDa。体外重组MeaC具有1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶活性和邻苯二酚1,2-双加氧酶活性。通过同源重组单交换插入突变菌株DE-13中双加氧酶基因meaC,发现插入突变株DE-13(pJQ-TYmeaC)与野生菌株DE-13降解1,2,4-苯三酚所积累的产物不同。该基因是否负责下游芳环的开环需要进一步的鉴定。