论文部分内容阅读
目的探讨第10号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酶基因(posphates and tensinghomologue deleted on chromosome 10,PTEN)抑制剂双过氧钒(biperoxovanadate,BPV)对细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的兔角膜基质细胞炎症因子释放的影响及可能机制。方法实验研究。采用组织块酶消化法获得原代兔角膜基质细胞并进行原代培养,选取第4代处于对数生长期的角膜基质细胞进行实验。预实验组设置正常对照组、不同浓度梯度的LPS、BPV组,MTT比色法检测各组角膜基质细胞存活率以确定后续实验中合适的LPS及BPV浓度。实验组分为正常对照组、LPS组、BPV组、LPS+BPV组,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测以上各组中炎性细胞因子白细胞介素-6(Interleukelin-6,IL-6)及白细胞介素-8(Interleukelin-6,IL-8)的m RNA表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测各实验组PTEN、磷酸化AKT的蛋白相对表达量。酶联免疫荧光吸附反应(enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa)检测各组上清液中IL-6、IL-8的表达量。组间均数比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果成功获得原代兔角膜基质细胞,常规培养后取第4代处于对数生长期的角膜基质细胞进行实验。在预实验的MTT检测中,以正常对照组细胞存活率为100%,LPS(0.1μg/ml)组、LPS(1μg/ml)组、LPS(10μg/ml)组的存活率分别为(98.9±3.56)%、(94.1±3.48)%、(86.6±2.80)%,总体差异具有统计学意义(F=73.29,P<0.01),组间两两比较后,选取1μg/ml作为LPS的模型建立浓度;BPV(250nmol/L)组、BPV(500nmol/L)组、BPV(1000nmol/L)组存活率分别为(96.0±2.23)%、(90.4±2.01)%、(86.0±2.47)%,总体差异具有统计学意义(F=41.86,P<0.01),组间两两比较后,选取500nmol/L作为BPV的实验浓度。实时荧光定量PCR检测结果显示,LPS刺激组IL-6及IL-8的m RNA表达量为1.79±0.19、1.37±0.18,明显高于正常对照组,差别有统计学意义(P<0.01);LPS+BPV组细胞IL-6及IL-8 m RNA表达量为1.23±0.15、1.05±0.14,明显低于LPS组,差别有统计学意义(P<0.01)。WB结果显示BPV组PTEN蛋白的相对表达量明显低于正常对照组,差别有统计学意义(P<0.01);LPS+BPV组细胞PTEN蛋白的相对表达量明显低于LPS组,差别有统计学意义(P<0.01)。LPS+BPV组磷酸化AKT蛋白的相对表达量明显高于LPS组,差别有统计学意义(P<0.01)。Elisa结果显示,LPS刺激组IL-6及IL-8的m RNA表达量为1.21±0.03、1.37±0.04,明显高于正常对照组,差别有统计学意义(P<0.01);LPS+BPV组细胞IL-6及IL-8 m RNA表达量为1.09±0.05、1.18±0.12,明显低于LPS组,差别有统计学意义(P<0.01)。结论LPS可促进角膜基质细胞炎性因子IL-6、IL-8的表达和分泌,角膜基质炎症模型成功建立;BPV可成功抑制角膜基质细胞PTEN的表达,达到实验预期要求;LPS可增加PTEN的表达,下调AKT的活化表达,提示PTEN、AKT可能参与到LPS引起的炎症反应的发生发展中;BPV可抑制LPS刺激后角膜基质细胞炎性因子IL-6、IL-8的表达和分泌,抑制的表达,上调AKT的表达活化;BPV可能通过抑制PTEN的表达,上调PI3K/AKT信号通路,抑制由LPS诱导的角膜基质细胞IL-6、IL-8基因表达从而减少炎症因子的分泌,从而起到抑制角膜基质细胞炎症反应的作用。