背景急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是最常见的造血系统恶性肿瘤,以高度异质性的造血干细胞和前体细胞的恶性克隆性增殖为特点,在成人急性白血病中约占70%。尽管随着临床及实验室诊疗手段的不断改进,AML的预后已有了显著改善,但目前尚有70%左右的患者确诊后无法存活超过5年。近年来,靶向血液系统恶性肿瘤疾病进程中关键分子的抑制剂,例如IDH1/2,BCL2,FLT3抑制剂在血液系统疾病中的应用日益增多,且取得良好效果。其中,靶向广泛表达于B细胞表面布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂在慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症等淋巴瘤患者中的应用获得美国FDA批准,但其在AML中的应用及其机制尚不完全明确,有关BTK抑制剂在AML中治疗方案仍需不断探索改进。目的收集健康捐献者外周血及AML患者骨髓单个核细胞标本,利用q-PCR检测BTK m RNA的表达量,根据其表达,分析BTK表达量在健康人和AML患者中有无差异,以及BTK表达和临床预后的关系。探究新型BTK抑制剂Abivertinib单药对AML细胞的抑制作用及其作用机制。研究Abivertinib联合传统化疗药物高三尖酯碱(HHT)或小分子口服BCL2抑制剂Venetoclax对AML细胞的抑制作用,分析其协同效应,通过体外细胞实验探索联合用药的作用机制,体内实验证明联合治疗的安全性及有效性。方法1.收集AML患者骨髓血及健康捐献者外周血标本,分离其中的单个核细胞,收集AML细胞系的细胞团块,提取总RNA,检测BTK m RNA表达。同时收集患者包括疾病诊断时间,年龄,性别,初发时的外周血白细胞数,血红蛋白量,血小板计数,骨髓原始细胞比例,染色体核型,基因突变类型,治疗方案,治疗效果,生存时间等临床资料。分析健康捐献者和AML患者BTK表达差异,并根据BTK的表达水平,将AML患者分组,使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验绘制并比较生存时间曲线。2.用新型BTK抑制剂,口服小分子药物Abivetinib处理急性髓细胞白血病细胞系及原代AML患者细胞,检测其对AML细胞的生长抑制作用,流式细胞术检测药物对细胞的凋亡及周期阻滞作用。并比较AML细胞对Abivertinib及传统BTK抑制剂Ibrutinib的敏感性差异。同时收集药物作用后的AML细胞,并用western blot等验证药物作用后凋亡相关蛋白、周期相关蛋白、BTK及其下游通路蛋白,常见肿瘤增殖相关信号通路蛋白的改变。对AML细胞进行基因干扰(RNAi)处理后观察AML细胞对Abivertinib敏感性变化以探索其作用机制。3.将Abivetinib及HHT单药或联合作用于AML细胞系及原代病人细胞,检测其生长抑制作用,计算联合指数。收集单药及联合药物作用后的细胞,流式细胞术检测药物对细胞的凋亡及周期阻滞作用,并用western blot等验证药物作用后凋亡相关蛋白、周期相关蛋白、BTK及肿瘤增殖相关信号通路蛋白的改变。4.收集6例使用“VA”(Venetoclax+阿扎胞苷)治疗方案的AML患者的骨髓单个核细胞标本进行RNA-sequence测序,其中3例患者获得了完全缓解(CR),3例患者不缓解(NR),根据结果分析出差异表达的基因。5.将Abivetinib及Venetoclax单药或联合作用于AML细胞系及原代病人细胞,检测其生长抑制作用,计算联合指数,流式细胞技术检测药物对细胞的凋亡及周期阻滞作用。收集单药及联合药物作用后的细胞,并用western blot等验证药物作用后凋亡相关蛋白、周期相关蛋白、BCR信号通路改变。对AML细胞进行基因干扰(RNAi)处理后观察两种药物在AML细胞中的协同作用变化以探索联合机制。6.Abivertinib联合HHT或Venetoclax对AML动物模型的治疗效果研究。将AML细胞(MV4-11-luc、MOLM-13、THP-1-luc)经尾静脉注射到NSG小鼠诱导其发生AML。通过荧光成像仪或每周采集外周血human-CD45表达来检测小鼠体内肿瘤负荷,并在小鼠出现肿瘤负荷后随机分组后分别给予安慰剂、Abivertinib单药、HHT或Venetoclax单药以及Abivertinib联合HHT或Venetoclax治疗。每周检测小鼠体内肿瘤负荷,每3天记录小鼠体重。待小鼠双下肢瘫痪时处死小鼠,收集骨髓、外周血和脾脏细胞检测human-CD45的表达,记录各组小鼠生存时间,进行生存分析。免疫组化检测小鼠脾脏和骨髓肿瘤细胞浸润程度。结果1.271例正常核型AML(CN-AML)患者及AML细胞系的BTK的表达水平高于健康人。但进一步的生存分析结果表明BTK高表达AML患者的总生存时间(OS)与低表达患者无统计学差异。2.新型BTK抑制剂Abivertinib可显著抑制AML细胞的生长,尤其是携带FLT3-ITD突变的AML细胞,且作用效果优于Ibrutinib;Abivertinib可以诱导AML细胞凋亡,激活外源性凋亡通路caspase家族蛋白的剪切带,下调线粒体家族抗凋亡蛋白BCL2/BCL-XL的表达;Abivertinib可下调G0/G1期检测点蛋白CDK2、CDK4及CDK6的表达,将AML细胞周期阻滞在G0/G1期;此外,Abivertinib可通过抑制BTK及其下游信号通路和异常激活的FLT3、PI3K等非BTK依赖途径从而抑制AML进展。3.Abivertinib联合HHT可显著抑制AML细胞的生长,联合指数均小于1,协同效果良好。联合组相比于单药诱导AML细胞凋亡明显增加,凋亡家族Cleaved Caspase3,7以及Cleaved PARP的表达上调以及BCL2/BCL-XL下调程度也以联合组最大;Abivertinib可协同HHT下调PI3K及其下游信号通路。4.对6例“VA”治疗方案的AML患者(3例CR及3例NR)的骨髓单个核细胞标本进行RNA-sequence,结果分析表明不可缓解患者的BTK表达量明显高于完全缓解患者,且该差异具有统计学意义,Tec家族其他成员的表达无统计学差异。5.Abivertinib联合Venetoclax可显著抑制AML细胞的生长,联合组相比于单药诱导AML细胞凋亡明显增加,凋亡家族Cleaved Caspase3,以及Cleaved PARP的表达明显上调,而MCL-1表达则被下调;联合组将AML细胞周期阻滞在G0/G1期,该细胞周期节点蛋白CDK家族蛋白被明显下调。Abivertinib与Venetoclax在AML中的协同作用在AML细胞BTK表达受损时消失,表明这种协同效应具有BTK依赖性。6.Abivertinib联合HHT或Venetoclax相比于单药能显著降低AML小鼠的白血病负荷,减少小鼠脾脏和骨髓的白血病浸润,延长小鼠的生存时间。结论本研究中,我们证实BTK基因在正常核型的急性髓细胞白血病中高表达,但AML患者BTK表达水平不影响患者预后。新型BTK抑制剂Abivertinib可抑制AML细胞生长,且作用效果优于Ibrutinib。Abivertinib联合化疗药物HHT或BCL2抑制剂Venetoclax能协同抑制白血病细胞的生长,促进AML细胞的凋亡,周期阻滞,抑制肿瘤增殖相关的信号通路,如FLT3、BTK、PI3K等。同时,体内试验证实联合用药能有效抑制AML小鼠的肿瘤负荷,延长小鼠的生存时间。