大网膜细胞外基质水凝胶与hiPSCs来源的心肌细胞生物相容性的研究

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目的:研究猪大网膜细胞外基质(ECM)水凝胶对人源诱导性多能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CMs)的生物相容性,并评估其作为心脏组织工程可注射水凝胶的可行性,为后续的在体实验提供细胞研究基础。方法:采用系列脱细胞工艺制备猪大网膜ECM水凝胶,观察该水凝胶的体外温度响应性,通过苏木素-伊红(HE)、天狼猩红、阿利新蓝等组织学染色检测所制备水凝胶的细胞成分残留及细胞外基质成分保留情况,使用扫描电子显微镜观察水凝胶的微观结构,在超声引导下向小鼠心肌内注射水凝胶,并通过后续的心肌组织HE染色检测水凝胶在体内的原位凝胶化的能力。使用小分子诱导方法,将hiPSCs在既定分化程序下定向分化成心肌细胞(hiPSC-CMs),并进一步纯化培养,随后采用心肌细胞标志物免疫荧光染色进行鉴定。将分化的hiPSC-CMs与水凝胶共培养,使用CCK-8实验、活/死细胞染色检测心肌细胞的细胞活力和生存状态,通过鬼笔环肽染色观察心肌细胞的骨架和生长形态,在光镜下观察心肌细胞的搏动情况,最后采用心肌细胞标志物免疫荧光染色及Western blotting实验分析心肌细胞生存数量和表型维持情况。结果:所制备的大网膜ECM水凝胶具有温度响应性,在4℃条件下为液态,37℃条件下为凝胶态。组织学染色结果提示水凝胶中无明显细胞成分的残留,而保留了细胞外基质的主要成分胶原蛋白和糖胺聚糖,扫描电镜检测可见水凝胶的微观形貌由交错的纤维和不规则孔隙组成。小鼠心肌内水凝胶注射及后续的HE染色结果提示水凝胶可在体内原位凝胶化。本研究成功将hiPSCs分化成具有搏动能力的心肌细胞,并通过心肌细胞标志物免疫荧光染色证实hiPSC-CMs分化成功,随后的CCK-8实验、活/死细胞染色结果提示hiPSC-CMs在与水凝胶共培养时细胞活力良好,大部分细胞存活。鬼笔环肽染色结果显示凝胶组和对照组的心肌细胞形态相似,且凝胶组细胞的F-actin表达面积与对照组无显著差异。心肌细胞标志物免疫荧光染色及Western blotting结果分析表明水凝胶支持心肌细胞的生存和表型的维持,利于心肌细胞簇同步电-机械活动。而且,光镜下观察到心肌细胞簇的搏动频率在两组间无明显差异。结论:本研究成功制备了温度响应性的猪大网膜ECM水凝胶,该水凝胶实现脱细胞化,保留了天然细胞外基质的主要生化组成,并有着复杂的纤维结构。此外该水凝胶具备微创注射和体内成胶的特点,并具有良好生物相容性、无明显细胞毒性的优点,可作为有效载体和支撑材料支持hiPSC-CMs的生存、收缩功能和表型维持,是一种有前景的可用于心脏组织损伤修复的生物治疗材料。
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