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副猪嗜血杆菌(HPS)是猪上呼吸道常在的一种革兰氏阴性菌，在一定条件下能够侵入宿主，引起宿主的格拉瑟氏病(Glasser)。近些年由于养猪规模的扩大和养猪模式的改变，副猪嗜血杆菌对养猪业造成的危害日趋严重，造成了巨大的经济损失。但是人们对于副猪嗜血杆菌毒力因子的研究仍然很少。1997年，Lichtensteiger在90％的副猪嗜血杆菌中检测到了神经氨酸酶的活性，认为神经氨酸酶可能是副猪嗜血杆菌一种极其重要的毒力因子。后来地方分离株SH0165全基因组测序完成后，发现了神经氨酸酶的基因nanH。
在关于其他细菌的报道中，神经氨酸酶是一种重要的毒力因子，主要与细菌的营养、粘附与入侵、毒素以及抵抗宿主的先天免疫有关。但是目前副猪嗜血杆菌神经氨酸酶的研究却甚少。本实验以副猪嗜血杆菌nanH为研究对象，对副猪嗜血杆菌不同标准株的神经氨酸酶序列和活性进行分析，同时通过原核表达获得了可溶性表达的有活性的神经氨酸酶。主要包括以下内容：
1.不同副猪嗜血杆菌标准株神经氨酸酶的测序及序列分析
以副猪嗜血杆菌15种血清型标准菌株基因组为DNA模板，使用引物nanHF/nanHR扩增nanH全基因。nanH基因扩增片段在15株标准血清型菌株中均为2007bp，含有668个氨基酸。核苷酸同源性为99.54%，氨基酸同源性为99.29%。使用神经氨酸酶检测试剂盒检测了13株标准株的神经氨酸酶活性，虽然神经氨酸酶的氨基酸序列在标准株内高度保守，但是不同标准株间神经氨酸酶活性却大不相同，高毒力的血清5型神经氨酸酶的活性大于除血清9型外的其余中低毒力菌株。证明神经氨酸酶与副猪嗜血杆菌的毒力有重要的关系。
不同细菌间比较，副猪嗜血杆菌nanH基因与多杀性巴氏杆菌(PasteurellamμLtocida)同源性达到60%，与溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)同源性达到58%，与其他非巴氏杆菌属如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)同源性达到38%，与索氏梭菌(Clostridium sordellii)同源性达到34%，与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)同源性达到31%。同时，对副猪嗜血杆菌15种血清型标准菌株nanH基因做进化树分析，发现高毒力菌株的神经氨酸酶亲缘性更接近。
2、副猪嗜血杆菌神经氨酸酶结构特点分析
首次分析了副猪嗜血杆菌的神经氨酸酶的结构，包含1个RIF功能域和2个Asp-box区，其活性区域包括由Arg163、Arg233构成的精氨酸三联体、Glu148、Tyr267和Asp182；精氨酸三联体与神经氨酸酶底物神经氨酸(Neu5Ac)的羧基相互作用，Glu148保持其中一个Arg的稳定性，保守的Tyr267的作用是发动亲核攻击，而Asp182可能起到催化的作用。
3、NanH的可溶性表达
以副猪嗜血杆菌SH0165基因组DNA为模板，以nanHF/nanHR为引物扩增nanH基因，获得2007bp的条带。将获得的片段连接到pET-32a原核表达载体上，转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞，挑取阳性克隆18℃过夜培养，集菌破碎后，使副猪嗜血杆菌神经氨酸酶以可溶性表达的形式存在，同时使用神经氨酸酶检测试剂盒检测有活性，为未来研究神经氨酸酶的功能打下基础。