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慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是以费城染色体(Philadelphia,Ph)为特征的骨髓恶性增殖性疾病。t(9;22)(q34;q11)染色体转位形成bcr-abl融合基因,编码的Bcr-Abl蛋白,具有持续活化的酪氨酸激酶活性,可导致自身酪氨酸残基磷酸化及许多重要的底物蛋白磷酸化,从而激活PI3K/Akt、Ras/MAPK等多条信号传导途径,使细胞恶性转化,过度增殖和凋亡受阻。Bcr-Abl是CML发病的分子基础,也造成细胞对化疗药物耐药。目前针对该病的发病机制所研制的靶向药物伊马替尼,因具有独特的作用机制和高效的特异性,临床上广泛用于CML病人的治疗。但是随着该药的应用,其不良反应及耐药问题相继出现,尤其在CML进展期。因此寻找抗CML新药成为研究热点。大黄素是中药大黄的有效成分,具有抗菌、抗炎、免疫抑制等广泛药理作用。大黄素还是蛋白激酶抑制剂,能够抑制多种肿瘤细胞的增殖。本课题以P210Bcr-Abl表达阳性的CML细胞株K562细胞、耐阿霉素的K562/A02及耐伊马替尼的K562/G01细胞为模型,研究大黄素(emodin)对这三种CML细胞株的作用特点及作用机制,包括对P210Bcr-Abl融合蛋白及其下游的PI3K/Akt、Ras/MAPK/ERK信号通路的影响。一、大黄素对K562细胞的作用及其机制研究研究大黄素对K562细胞增殖、凋亡的影响;P210Bcr-Abl蛋白、磷酸化P210Bcr-Abl及凋亡相关基因、蛋白的变化;对P210Bcr-Abl下游PI3K/Akt、MAPK/ERK信号通路的影响。方法:1.MTT法、集落形成法检测大黄素对K562细胞增殖抑制作用,同时MTT检测大黄素对正常人单个核细胞增殖的影响;2.Annexin V FITC/PI、DNA倍体分析、细胞DNA片段化、TdT酶介导的末端缺失原位标记(TUNEL)法检测大黄素对K562细胞凋亡的影响;3.流式细胞术检测线粒体膜电位、caspase-3活性的改变;4.实时定量PCR测bcr-abl mRNA表达变化;5.蛋白印迹(Western blot)测P210Bcr-Abl及磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl);6.RT-PCR、Western blot检测大黄素作用前后增殖、凋亡相关基因、蛋白的改变;7.Western blot检测及PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路关键蛋白表达水平的变化。结果:1.大黄素抑制K562细胞增殖,呈时间和剂量依赖关系;大黄素的抑制增殖作用在正常人单个核细胞与K562细胞之间有一定选择性,在对K562细胞抑制超过90%时,对正常人单个核细胞抑制率不到10%。2.大黄素诱导K562细胞凋亡,呈剂量依赖关系。3.大黄素作用后K562细胞线粒体膜电位降低、caspase-3活性增强。4.大黄素作用后K562细胞的bcr-abl mRNA表达无明显改变。5.大黄素下调P210Bcr-Abl及p-P210Bcr-Abl蛋白含量,且呈时效和量效关系。6.大黄素下调与细胞增殖和凋亡有关的信号分子c-myc、Mcl-1、hTERT及procaspase-3、procaspase-9,上调bax,对bcl-2无明显影响。7.大黄素下调PI3K/Akt信号通路的p-Akt、IκB-α、p-IκB-α、NF-κB、mTOR、p-mTOR的表达,而对Akt的表达无明显影响;下调了MAPK信号通路p-MAPK(ERK1/2)蛋白的表达,MAPK(ERK1/2)无明显改变。二、大黄素提高耐阿霉素的K562/A02细胞对化疗药物的敏感性肿瘤细胞多药耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因之一,也是白血病缓解后复发的重要根源。这部分研究大黄素对耐药细胞株K562/A02作用及大黄素与化疗药物合用能否增强抗肿瘤作用,并进一步探讨其作用机制。方法:MTT法测细胞增殖;Annexin V FITC/PI测凋亡;流式细胞术检测大黄素处理后K562/A02细胞内阿霉素浓度;RT-PCR测mdr1 mRNA;Western blot检测P-gp (P170)和谷氨酰转移酶π(GSTπ)。结果:1.大黄素抑制多药耐药K562/A02细胞增殖,诱导细胞凋亡。2.大黄素与化疗药物阿霉素、阿糖胞苷、长春新碱、高三尖杉酯碱联用能增强其抗肿瘤作用,有协同效应,部分逆转K562/A02细胞的耐药性。3.其作用机制可能与降低P-gp及GSTπ蛋白的表达,增加K562/A02内ADM的浓度有关。三、大黄素单独或与伊马替尼合用对耐伊马替尼的K562/G01细胞株的作用及相关制研究伊马替尼耐药主要与Bcr-Abl过量表达和突变有关。大黄素能抑制P210Bcr-Abl蛋白的表达,因此大黄素可能对耐伊马替尼的K562/G01细胞有效,增强伊马替尼的作用效果。方法:MTT法检测大黄素单独或联合伊马替尼对K562/G01的增殖抑制作用;Annexin V FITC/PI、DNA倍体分析、DNA片段化分析测凋亡;Western blot法检测P210Bcr-Abl、p-P210Bcr-Abl及其下游信号通路的CRKL、p-CRKL、PI3K/Akt、MAPK/ERK信号通路的关键蛋白,凋亡相关的procaspase-3,核基质蛋白B23、C23。结果:1.大黄素能够抑制耐伊马替尼的K562/G01细胞增殖,诱导凋亡。2.大黄素与伊马替尼联合作用可增强对K562/G01增殖抑制和凋亡诱导。3.大黄素与伊马替尼联合作用可协同降低K562/G01细胞P210Bcr-Abl蛋白及p-P210Bcr-Abl蛋白水平。4.大黄素可作用于P210Bcr-Abl下游PI3K/Akt、MAPK/ERK信号通路及与细胞增殖和凋亡有关的信号分子等而抑制K562/G01细胞增殖和促进其凋亡。5.大黄素能降低K562/G01细胞的P-gp表达,这可能与克服耐药有关。结论:1.大黄素能有效抑制慢性粒细胞白血病K562细胞株及其耐药株K562/A02、K562/G01细胞的增殖,诱导凋亡。2.大黄素作用机制是多靶点:包括下调P210Bcr-Abl、p-P210Bcr-Abl蛋白水平及其下游PI3K/Akt、MAPK/ERK信号通路及调节与细胞增殖和凋亡有关的信号分子。3.大黄素能够增强化疗药物及伊马替尼对耐药细胞株的作用,部分逆转耐药性。