近年来,中药复方相互配伍减毒增效受到越来越多研究者的关注,有毒中药附子因其疗效好被广泛应用于临床,但附子具有明显的毒副作用一直是人们广为关注的重点问题。国家重点基础研究发展计划(973项目)“有毒中药配伍减毒原理和方法学研究(2009CB522806)”从配伍减毒文献、理论、方法和评价标准等方面进行了有毒中药的系统研究。本课题为其研究内容的一部分,主要对含有有毒中药附子的经典方剂“四逆汤”组方进行拆方比较四逆汤组方不同配伍(单用附子、附子与甘草、附子与干姜、附子与甘草干姜即四逆汤全方)对于附子主要成分,附子急性毒性、毒性靶器官—心脏毒性的毒理学研究以及对心衰模型大鼠心功能方面的影响,结合乌头碱含量测定主要从毒理学和药效学两方面系统的分析了四逆汤组方配伍的科学意义,为中药配伍减毒提供了一定的实验依据,并为临床上安全、合理的应用有毒中药提供用药参考。1四逆汤组方配伍中乌头碱类成分的含量测定以本试验研究所用的供试药物样品进行物质基础研究,采用高效液相色谱法同时对四逆汤组方中附子及其不同配伍(均含附子生药1g/ml)水煎液中的单酯型生物碱和双酯型生物碱进行含量测定。对结果进行分析显示四种样品溶液中均未检出乌头碱,附子单煎与附子配伍甘草未检出新乌头碱。同单用附子比较附子与甘草、干姜配伍以及四逆汤全方所测乌头碱类单酯型生物碱和双酯型生物碱含量均降低；附子配伍甘草双酯型生物碱总含量(比附子降低40.1%)比附子配伍干姜(比附子降低9.2%)降低30.9%,与全方(39.8%)接近。2四逆汤组方配伍的毒理学研究2.1四逆汤组方中附子及其不同配伍对小鼠半数致死量LD50的影响本实验采用与临床一致的口服给药途径,小鼠灌胃给药通过预实验获得0%(全没死)和100%(全死)致死量范围,选择附子及其不同配伍四种水煎液,分别选择5个剂量,用倍比稀释法配制进行实验。小鼠适应性喂养3天后,每种药液分别取小鼠50只,随机分为5组,每组10只动物,实验前禁食不禁水16h,小鼠灌胃0.4m1/10g体重。实验从中间剂量开始,灌胃给予小鼠一次不同剂量的药液,给药后密切观察动物的毒性反应情况,记录实验完毕后各组动物死亡数,用Bliss程序统计处理并计算小鼠的LD5o及LD5o的95%可信区间。结果显示附子、四逆汤全方、附子+干姜、附子+甘草给药后动物表现同单用附子；但是同单用附子LD50比较,四逆汤、附子+干姜和附子+甘草提高的比例分别为23.6%、11.8%和32.8%。由此可见,在提高附子半数致死量上附子配伍甘草要比附子配伍干姜提高21%,比全方提高9.2%。2.2四逆汤组方中附子及其不同配伍对正常大鼠半数中毒量TID50的影响SD大鼠适应性喂养5天后开始实验,实验前动物禁食不禁水16h后,先用3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射将大鼠麻醉,仰卧固定。使用16通道多导生理记录仪检测动物心电图,正向电极插入动物右上肢,负向电极插入动物左下肢,地线接右下肢,连续观察10分钟,心电图有异常者弃用。动物腹部酒精消毒,腹白线剪开动物腹腔,从胃幽门部进针,十二指肠注射给药2ml/100g体重。实验首先以小鼠附子LD50的1/2为初始剂量,使用MP150型多导(16道)生理记录仪连续观察60分钟,以心脏持续出现各类型心律失常作为心脏中毒的阳性观察指标。组间距0.8,每组6只动物,得到全部动物中毒剂量和全部动物未出现心脏毒性剂量,记录实验完毕后各组动物中毒数,用Bliss程序统计处理并计算大鼠的TD5o及TD5o的95%可信区间。结果显示附子、四逆汤全方、附子十干姜、附子+甘草给药后动物中毒表现同单用附子,主要出现各类型心律失常。同单用附子TD5o比较,四逆汤、附子+干姜和附子+甘草提高的比例分别为28.6%、-63.1%和45.2%。由此可见,在提高附子TD50上附子配伍甘草比四逆汤全方高16.6%,而附子+干姜TD5o比单用附子降低63.1%。2.3四逆汤组方不同配伍中乌头碱类成分与毒性作用的相关性分析应用SPSS13.0软件,分别以药液中三种双酯型乌头碱总含量为因变量,毒理学结果LD50和TD50为自变量,对毒性作用与双酯型乌头碱总含量进行相关性分析。结果显示双酯型乌头碱总含量均与LD50和TD50呈负相关,即与毒性作用呈正相关。说明四逆汤组方配伍的双酯型乌头碱总含量高,则毒性作用强,进一步说明含量最低的附子配伍甘草组毒性最低。根据以上研究结果显示：四逆汤组方配伍中甘草对附子的减毒起到主要作用。3四逆汤组方配伍的药效学研究3.1四逆汤组方中附子及其不同配伍对心衰大鼠心功能方面的主要药效学影响SD大鼠适应性喂养5天后称重,按体重随机分为：正常对照组、模型对照组、阳性对照组(地高辛)、四逆汤全方高、低组、附子高、低组、附子配伍甘草高、低组、附子配伍干姜高、低共11组,每组8只动物。除正常对照组外,其余各组动物尾静脉注射盐酸阿霉素注射液4mg/kg (0.2ml/100g体重),正常对照组注射等体积生理盐水,7天后再注射一次。造模当天开始灌胃给予相应药物,连续14天,给药体积1ml/100g体重,正常对照组和心衰模型组灌胃等体积蒸馏水。末次给药后各组动物称重,先用3%水合氯醛溶液腹腔注射将大鼠麻醉,仰卧固定。沿动物颈部正中切开,暴露并钝性分离右侧颈总动脉后,连接血流量计测量颈动脉血流量；然后撤掉并结扎远心端,动脉夹夹住近心端,在结扎线下方用眼科剪剪—小斜口,将Millar导管由动脉壁切口向心脏方向缓慢推入左心室固定,连接16通道生理记录仪,稳定3分钟后轻扎导管持续观察十分钟并记录以下指标：心率(HR)、左室收缩压(LVSP)、.左室舒张末压(LVEDP)、左心室内压力最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压力最大下降速率(-dp/dtmin).结果显示：同正常对照组比较心衰模型组动物LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、HR和颈动脉血流量均显著降低,-dp/dtmin显著升高(P<0.05,P<0.01),证明造模成功。同模型组比较,四逆汤全方和附子配伍干姜均能显著提高各组大鼠LVSP、+dp/dtmax、HR及颈动脉血流量,能显著降低-dp/dtmin,均有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。而附子配伍甘草组和单用附子组只能显著提高心衰大鼠HR和颈动脉血流量(P<0.05,P<0.01)。同单用附子比较四逆汤全方高低和附子配伍干姜高可明显提高LVSP、+dp/dtmax,而附子配伍甘草与单用附子没有作用。四逆汤组方不同配伍对心衰模型大鼠体重比较结果显示,同正常对照组比较,模型动物体重显著降低,两者均有显著性差异(P<0.05,P<0.01)；同模型组比较各给药组动物体重有上升趋势但无显著性差异。3.2四逆汤组方不同配伍中乌头碱成分与药效作用的关联性分析由于双酯型乌头碱是附子类药材的主要药效成分,组方的药效作用直接受乌头碱含量的影响。综合四逆汤组方不同配伍的双酯型乌头碱总含量测定和药效学试验结果(选取与心脏功能密切相关的LVSP和+dp/dtmax两个主要指标),对二者进行综合性分析。结果显示,在本试验条件下附子单煎的双酯型乌头碱总含量最高,其次是附子配伍干姜、四逆汤全方,附子配伍甘草最低；比较药效学指标,附子单煎的药效作用最差,依次是附子配伍甘草,全方高低和配伍干姜高药效作用最明显。双酯型乌头碱含量较高的附子配伍干姜的药效作用强于含量较低的附子配伍甘草说明配伍干姜在药效方面强于配伍甘草,而含量低于附子配伍干姜的全方的药效作用强于附子配伍干姜,说明四逆汤全方在附子配伍甘草抑制毒性的前提下配伍干姜使药效作用达到最佳。综上分析可见四逆汤组方不同配伍中药效成分较高的附子配伍干姜主要是在药效作用上有促进作用。即干姜对附子药效起主要促进作用。综上所述,四逆汤在组方配伍中充分考虑组方的有效性和安全性,配伍干姜是在促进附子的药效作用起到主要作用,而配伍甘草在降低附子的毒性起到了主要作用。体现出配伍的合理性,也充分体现出中药复方配伍的复杂性。正如《证治要诀》云：“附子无干姜不热,得甘草则性缓”。