研究背景:角膜(Cornea)位于眼球前壁的一层透明膜,约占纤维膜的前1/6,从后面看角膜呈正圆形,正常的角膜是没有血管,血管终止于角膜缘,但是由于致病因素在角膜缘形成血管网,并且部分新生血管进入角膜内,这个新生血管网被称为角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)。新生血管是角膜活动性炎症的一个标志,新生血管的发生发展取决于炎性刺激物的性质,一旦血管离开了正常的血管网侵入到角膜,就是角膜血管翳。角膜的新生血管是机体组织对各种侵致病因素的代偿反应,随着它对感染的消除、创伤愈合、抑制免疫介导的角膜溶解有一定作用,但其结构和功能不完善,容易发生血浆渗漏,造成角膜水肿、脂质沉着以及激发的角膜瘢痕化,严重影响视力;也使角膜移植排斥反应的发生率大大增加严重危害患者视力,抑制角膜新生血管的发生发展一直是眼科棘手的问题。mi R296位于染色体20q13.32处,在全身的疾病及部分器官体外实验中,现已证实mi R-296通过直接抑制其靶基因FGF23表达,可以促进新生血管的作用,有学者研究证实mi R-296的分子作用是与新生血管生成有关,是一个较好的新生血管的抑制剂。但是目前在角膜新生血管与mi RNA-296相关的研究报道较少。本实验将通过二部分内容来研究,第一部分:通过建立小鼠碱烧伤模型后明确mi R-296在角膜新生血管的表达;第二部分探讨阐明mi R-296参与调控角膜血管新生的分子机制,为各种致病因素引起的角膜新生血管治疗提供新的治疗方法。研究内容:BALB/C小鼠78只,均由南昌大学医学院实验动物科学部提供,重量为35~45g,全部为雄性;双眼均为实验眼。碱烧伤后随机将78只小鼠分为2个实验组和1个对照组,实验组A:氯替泼诺混悬滴眼液+左氧氟沙星滴眼液;实验组B:他克莫司滴眼液+左氧氟沙星滴眼液;对照组C:滴左氧氟沙星滴眼液每日3次作为阴性对照,共观察21天。所有实验动物均于造模后1d开始,给予左氧氟沙星滴眼液点眼每日4次,连点三日。第一部分:角膜新生血管的模型建立和mi RNA296在体外表达检测方法:1.1采用裂隙灯显微镜下观察:测量各实验组的小鼠角膜新生血管新生血管长度以计算新生血管化面积、记录新生血管数。1.2采用免疫组化染色法:检测实验组的小鼠碱烧伤后不同时间点角膜新生血管VEFE在角膜新生血管的表达情况。1.3采用q RT-PCR方法检测BALB/C小鼠碱烧伤后不同时间点角膜新生血管mi RNA-296的表达水平,明确小鼠碱烧伤后角膜新生血管mi RNA 296的动态表达变化。结果:(1)实验A组和B组的角膜新生血管发生较迟、生长缓慢、新生血管化面积小,和对照C组比较,在统计学上差异性有显著性(P<0.05),实验A组小鼠的角膜新生血管面积低于实验B组和对照C组,在统计学上差异性有显著性(P<0.05)(2)免疫组化染色显示:对照C组的角膜新生血管组织的VEGF表达较实验A组和实验B组明显减少;实验B组的VEGF的表达较实验A组明显减少;各组之间的差异性有统计学意义(P<0.05)。(3)免疫组化染色VEGF的炎性细胞数结果显示:角膜碱烧伤后7d,实验A组角膜新生血管组织出现VEGF炎性细胞数(13.23±3.09);实验B组炎性细胞数(16.24±3.68);对照C组的炎性细胞数(31.06±3.52),各组之间的差异性有统计学意义(P<0.05)。(4)RT-PCR检测角膜组织中mi RNA296。在造模后各实验组和对照组在各个时间点的相对表达量,实验A组低于实验B组和对照C组,差异性有统计学意义(P<0.05)结论:1)氯替泼诺混悬滴眼液可有效抑制碱烧伤小鼠角膜新生血管的增殖,并可减少角膜组织新生血管的生成。2)他克莫司滴眼液虽然可以有效抑制碱烧伤后小鼠角膜新生血管的增殖,但是效果没有氯替泼诺混悬滴眼液抑制角膜新生血管的增殖有效。3)免疫组化染色结果显示:角膜碱烧伤后7d,实验A组和B组的角膜新生血管组织出现VEGF炎性细胞数与对照C组的炎性细胞数是减少的,VEGF促进碱烧伤小鼠角膜新生血管的发生发展,同时激素和免疫抑制剂可以抑制VEGF的表达。4)q RT-PCR结果显示,角膜碱烧伤后可各时间点小鼠角膜新生血管的mi R-296表达均低于正常角膜组织,(各P<0.05),mi R-296在实验A组中角膜碱烧伤后第1天表达即开始下调(0.472997±0.136016),第7天表达量继续上调(0.452387±0.126035),10天时最明显(0.432532±0.138526),表明小鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管存在mi R-296的表达,且碱烧伤可刺激mi R-296表达水平的逐渐下调。第二部分:mi R-296参与调控角膜血管新生的分子机制作用研究研究方法:2.1采用Western blot法检测BALB/C小鼠碱烧伤后不同时间点小鼠新生血管FGF32的蛋白表达,明确小鼠碱烧伤后不同时间点小鼠新生血管后mi R-296的靶基因FGF32的蛋白表达变化。2.2通过芯片技术预测的mi RNA296的靶基因,探讨FGF23、VEGF、IL-6角膜新生血管的信号通路机制。结果:(1),W-B检测角膜组织中mi RNA296的靶基因FGF23表达量。在造模后各实验组和对照组在各个时间点的FGF32的蛋白表达量逐渐下调,实验A组低于实验B组和对照C组,差异性有统计学意义(P<0.05)(2)建立角膜新生血管的碱烧伤的模型,mi R-296在实验组中碱烧伤大鼠角膜新生血管角膜组织的表达量(0.245±0.024)较对照C组的角膜组织表达量(1.136±0.126)显著下调(P<0.01)。(3)mi RNA 296在芯片技术检测FGF23 m RNA的表达水平下降,其蛋白水平则显著下降。与此同时,VEFE的m RNA和蛋白表达水平均显著上调,而FGF23的m RNA和蛋白表达水平均显著下降(各P<0.05)(4)通过芯片技术检mi RNA预测的靶基因与FGF23、VEGF、IL-6血管生成信号通路有关。结论:1)Western-blot结果显示检测角膜碱烧伤后可各时间点小鼠角膜新生血管的1d,3d,7d实验组小鼠角膜新生血管的FGF23的蛋白表达逐渐下降,验证了小鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管表达的mi R-296可抑制其靶基因FGF23的蛋白表达。2)采用western blot法检测mi R-296可上调角膜新生血管内皮细胞VEGF-VEGFR信号通路,下调FGF23信号通路。3)mi R-296靶基因生物信息学预测筛选差异的基因分析我们通过利用芯片筛查在碱烧伤诱导角膜新生血管形成的过程筛查了24个基因,其中FGF23、VEGF、b FGF,IL6等有9个炎症因子参与了角膜新生血管的表达