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细胞凋亡是维持机体内环境平衡、排出机体不必要、有害细胞等的过程,又称为程序性死亡。哺乳动物卵巢卵泡发育过程中,卵巢上所有的卵泡都要经历退化、闭锁的过程,只有少数卵泡发育成熟。颗粒细胞在卵泡发育过程中发挥关键作用,并且与卵泡闭锁等过程密切相关。Kisspeptins(Kp)是由KiSS-1基因编码的肽类激素,通过G蛋白偶联受体(G protein-couple receptor-54)GPR54发挥作用。Kp通过调节下丘脑GnRH分泌,影响促卵泡素和促黄体素的分泌,在下丘脑、肝、胰、胎盘、卵巢等组织中有表达。本实验室前期研究发现,Kp在牛卵巢颗粒细胞上有表达,并能促进牛颗粒细胞凋亡,但其调控机制尚不清楚。本试验选用100 nM的kp-10处理牛颗粒细胞24 h,利用miRNA-mRNA测序关联分析技术筛选参与kisspeptin促进牛颗粒细胞凋亡的miRNA及其靶基因。根据miRNA-mRNA联合分析结果,获得114个差异表达的mRNAs,61个差异表达的miRNAs,2438个GO富集功能差异的miRNA-mRNA,9个差异显著的KEGG信号通路。荧光定量PCR法验证部分差异表达的miRNA和mRNA表达量,结果与miRNA-mRNA联合分析测序技术基因表达结果趋势相同,证明高通量结果的准确性。根据miRNA-mRNA联合分析结果发现,miR-27b与SFRP2可能参与Kp对牛颗粒细胞凋亡的促进作用。利用双荧光素酶试验明确miR-27b与SFRP2的靶向关系。成功构建了SFRP2基因3’-UTR端的重组型及突变型载体,选用psiCHECK-2质粒,构建psiCHECK-2-SFRP2-3’-UTR、psiCHECK-2-mut-SFRP2-3’-UTR重组载体质粒,成功转染到293T细胞,通过检测萤火虫及海肾型荧光素酶的活力比值,明确了SFRP2与miR-27b的靶向关系。miR-27b能与SFRP2-3’UTR端靶标位点结合,抑制转录后SFRP2的表达,荧光定量PCR法进一步验证miR-27b与SFRP2靶向关系,证实SFRP2是miR-27b的靶基因。利用流式细胞术、荧光定量PCR法和细胞转染等技术研究kisspeptin与miR-27b及其靶基因SFRP2在调节牛颗粒细胞凋亡中的关系,揭示kisspeptin调控牛颗粒细胞凋亡的机制。研究发现,miR-27b mimic促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡,miR-27b inhibitor促进牛颗粒细胞凋亡(P<0.05),提示miR-27b可抑制牛颗粒细胞凋亡;miR-27b mimic与kp-10共同作用促进牛颗粒细胞凋亡,miR-27b inhibitor与kp-10共同作用显著促进牛颗粒细胞凋亡。流式细胞术显示SFRP2 siRNA显著抑制牛颗粒细胞凋亡,促凋亡基因caspase-3表达量显著下降,抗凋亡基因Bcl-2基因表达量显著升高。miR-27b mimic与SFRP2 siRNA共同作用抑制颗粒细胞凋亡,miR-27b inhibitor与SFRP2 siRNA共同作用促进牛颗粒细胞凋亡(P<0.05)。本试验结果表明,Kp通过miR-27b靶向SFRP2基因表达调节而促进牛颗粒细胞凋亡。研究结果不仅揭示了kisspeptin调控牛颗粒细胞凋亡的分子机制,而且丰富了牛颗粒细胞凋亡的调控网络。