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第一部分川芎嗪对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖及凋亡的影响乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有120万妇女罹患乳腺癌,占所有女性恶性肿瘤的18%。传统的化学药物治疗,效果明显,副作用严重。寻找一种理想的药物成为近来关注的热点。川芎嗪是由中药伞形科植物的根茎提取的有效成分,逆转肿瘤多药耐药及抗肿瘤已经在许多的研究中得到证实。但川芎嗪对乳腺癌细胞增殖及侵袭的研究未见报道。本部分研究以体外培养的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231为研究对象,观察川芎嗪对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响。方法1、MTT法检测川芎嗪对MDA-MB-231细胞增殖的作用:设0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL、1.50mg/mL、2.00mg/mL川芎嗪干预组,对照组仅加等量的培养液,各浓度复5孔。每隔2d更换含同样药物浓度的新鲜培养液,分别培养24h、48h、72h,加入MTT继续孵育4h后,酶标仪测570nm吸光度(A)值。实验重复2次,细胞增殖抑制率=(对照组A值-处理组A值)/对照组A值×100%。2、PI单染流式细胞仪检测川芎嗪对MDA-MB-231细胞周期的影响:设对照组及0.50mg/mL、1.00mg/mL、1.50mg/mL川芎嗪干预组。药物作用48h后收集细胞,离心,重悬,PBS洗涤,RNA酶处理,加入400μL PI,室温反应30min。计算机软件分析细胞周期的分布。实验重复3次。3、Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞仪检测川芎嗪对MDA-MB-231细胞凋亡的影响:设对照组及0.50mg/mL, 1.00mg/mL和1.50mg/mL川芎嗪干预组。药物作用48h后收集细胞,取100μL细胞悬液于流式管中,加入Annexin-Ⅴ-FITC和PI各5μL,冰浴避光孵育10min后在流式细胞仪上测定。实验重复3次。4、细胞形态观察设对照组及0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL川芎嗪干预组,药物作用48h后直接在倒置显微镜下观察细胞形态,然后收集细胞,用2.5%的戊二醛固定2h,固定脱水包埋后,透射电镜下观察细胞超微结构。5、统计学处理数据以X±S表示。应用SPSS17.0统计软件进行方差分析。显著性检验水平为α=0.05。结果1、川芎嗪对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用川芎嗪在一定浓度范围(≥0.5mg/ml)能显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖,且其增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性。较低浓度(≤0.25mg/ml)对MDA-MB-231细胞的抑制作用不明显,即使作用时间延长,抑制也不明显。2、流式细胞仪检测结果川芎嗪能使S期肿瘤细胞比例减少,G0/G1期肿瘤细胞比例增加,而且在G0/G1期被阻滞的肿瘤细胞数随着川芎嗪浓度增加而增多。随着川芎嗪浓度(0.50mg/mL～1.50mg/mL)的增加,凋亡的MDA-MB-231细胞增多,其作用呈浓度依赖性。3、川芎嗪作用前后细胞形态学的改变光及电镜均观察到川芎嗪作用后MDA-MB-231细胞的凋亡现象,随着浓度(0.50mg/mL～2.00mg/mL)的增加,贴壁及粘附的细胞数目减少。1.0mg/ml时,胞浆内可见明显的空泡样变。结论1、川芎嗪能抑制MDA-MB-231细胞的体外增殖,在一定的浓度范围内(≥0.50mg/ml),其抑制作用随着时间和浓度的增加表现出时效和量效关系。2、川芎嗪阻滞MDA-MB-231细胞周期于G0/G1期,并诱导细胞凋亡,表现出浓度依赖性。3、川芎嗪可能通过阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导凋亡。第二部分川芎嗪对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞侵袭、黏附的影响第一部分的研究证明,川芎嗪可以抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖并诱导凋亡,而侵袭、黏附行为也是肿瘤细胞的重要特征,参与了肿瘤的复发转移。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)通过降解细胞外基质及基底膜,促进肿瘤向远处转移。本部分实验以MDA-MB-231细胞为研究对象,观察不同浓度川芎嗪干预后乳腺癌细胞侵袭、黏附能力的改变及MMP-2/MMP-9的表达,探讨川芎嗪抑制乳腺癌细胞侵袭、黏附的作用机制。方法1、细胞黏附实验96孔板每孔铺Matrigel凝胶30μl,2% BSA 20μl封板。收集不同浓度川芎嗪干预满24h的MDA-MB-231细胞,以5×104/ml接种到96孔板上,设对照组及0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL川芎嗪干预组,各组复4孔。37℃培养1h后,PBS洗去未黏附细胞,加入MTT继续孵育4h后,酶标仪测570nm吸光度(A)值。实验重复3次。细胞黏附抑制率=(对照组A值-处理组A值)/对照组A值×100%。2、Transwell侵袭实验Transwell小室底部铺上Matrigel凝胶100μl,置于24孔板内。收集MDA-MB-231细胞以无血清RPMI1640制成2×105/ml单细胞悬液,取100μl移入小室,设对照组及0.50 mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL川芎嗪干预组,各组复3孔。孵育24h后以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞,固定后在400倍高倍显微镜下计数。侵袭细胞数=各下室面黏附的细胞数+相应24孔板黏附的细胞数,细胞侵袭抑制率=(对照组侵袭细胞数-处理组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数×100%。3、半定量逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)检测MMP-2/MMP-9的表达设对照组及0.50 mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL川芎嗪干预组。药物作用24h后收集细胞。抽提细胞总RNA,进行逆转录和PCR扩增;MMP-2扩增35个循环,其扩增片段长度为346bp;MMP-9扩增35个循环,其循环片段长度为214bp;以β-actin为内参照,扩增35个循环,其扩增片段长度为474bp。实验重复2次。4、统计学处理数据以X±S表示。应用SPSS17.0统计软件进行方差分析。显著性检验水平为α=0.05。结果1、川芎嗪对MDA-MB-231细胞黏附力的抑制作用与对照组相比,各实验组培养细胞黏附Matrigel凝胶的能力明显降低,其抑制率分别为16.65±3.16%、35.17±2.20%、57.97±2.29%。川芎嗪对MDA-MB-231细胞黏附力的抑制作用呈剂量依赖性。2、川芎嗪对MDA-MB-231细胞侵袭力的抑制作用0.50 mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL川芎嗪对MDA-MB-231细胞的侵袭抑制率分别为24.65±3.11%、41.64±3.52%、53.75±2.64%,与对照组相比,各浓度川芎嗪干预组侵袭细胞数均明显减少,且川芎嗪干预组组间差异显著。3、川芎嗪对MDA-MB-231细胞MMP-2/MMP-9表达的抑制作用对照组和各川芎嗪干预组的MMP-2/β-actin光密度比值分别为1.08±0.04、0.89±0.04、0.64±0.10、0.45±0.12。与对照组比较,川芎嗪各浓度组MMP-2 mRNA表达量均显著降低,而且随着川芎嗪浓度的增加,川芎嗪的抑制作用具有明显的剂量依赖性。MMP-9mRNA表达量未见明显变化。结论1、体外研究表明川芎嗪能显著抑制MDA-MB-231细胞的黏附和侵袭能力,其抑制效应与药物的浓度呈正相关。2、川芎嗪能下调MDA-MB-231细胞MMP-2 mRNA的表达,并且在一定的剂量范围内,表现出剂量依赖性;川芎嗪对MMP-9mRNA的表达未见明显影响。3、川芎嗪可能通过下调MDA-MB-231细胞MMP-2mRNA的表达而抑制细胞的黏附、侵袭能力。