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越来越多的多肽、蛋白质与酶(统称为蛋白质)药物用于临床。采用生物可降解高分子制备蛋白质控释制剂,可以延长蛋白质的半衰期,改变给药途径,减少副作用。提高载药量是蛋白质纳米制剂具备实用前景的关键。采用生物可降解聚电解质包封蛋白质的纳米聚集体,有望使这一问题得以解决。
聚(α,β-L-苹果酸)(α,β-PMA)是一种生物可降解聚电解质,通过L-苹果酸的熔融缩聚法制备,其结构和性能采用凝胶渗透色谱法(GPC)、核磁共振法(NMR)、红外光谱(IR)、拉曼光谱(Raman)、X-射线粉末衍射法(XRD)、热重法(TG)以及差示扫描量热法(DSC)等测试手段进行表征。α,β—PMA存在支化结构,主链由α-与β-苹果酸残基以相近比例随机连接而成,端基主要为苹果酸残基,存在少量的富马酸残基。本文详细研究了反应时间对α,β—PMA分子量和化学结构的影响。通过优化反应条件,制得数均分子量达到4500g/mol、支化度约为10%、端羟基含量约为80%的非晶态α,β—PMA。在研究α,β—PMA性能的过程中,发现α,β-PMA在水中以新的机理发射荧光,它的最大激发波长为340nm,最大发射波长为420nm。本文详细研究了分子量、浓度与pH对α,β-PMA荧光强度的影响,并探究了其荧光产生机理。
α,β-PMA的衍生物采用化学修饰法制备,以降低α,β—PMA的水溶性。以碘甲烷为甲基化试剂制备甲基化α,β—PMA(EPMA);以丙胺为胺化试剂制备酰胺化α,β-PMA(APMA)。它们的结构与性能采用GPC、<1>H NMR、IR、TG以及DSC等测试手段进行研究。通过改变修饰试剂与高分子结构单元的摩尔比,获得不同修饰程度的EPMA或AMPA,产物的水溶性明显降低。
水溶性壳聚糖(WSC)也是一种生物可降解聚电解质,采用H<,2>O<,2>异相降解法制备,其结构和性能采用粘度法、GPC、<1>H NMR、XRD等方法进行表征。本文主要考察了反应温度、反应时间、以及H<,2>O<,2>与壳聚糖中糖单元摩尔比对WSC分子量和产率的影响,并获得分子量为8900g/mol的非晶态WSC。
胰岛素纳米聚集体通过盐析法获得。通过调节溶液的pn和NaCl浓度,并经过适当的低温超声波处理,目前已经得到粒径为100~230nm的不规则椭球形纳米聚集体。聚集体中胰岛素主要是无定形的,其分子构象没有明显变化。
采用α,β-PMA和WSC在胰岛素纳米聚集体上交替吸附,以制备胰岛素-聚电解质纳米粒子。这些粒子的性质在扫描电镜(SEM)、激光粒度分析仪、ζ电位仪等仪器上测定。目前已经获得聚电解质多层膜最多为8层的胰岛素-聚电解质纳米粒子,载药量约为53%,低温超声波分散后,粒径在100~250nm之间。本文研究了培养液pH以及聚电解质层数对α,β-PMA/WSC多层膜渗透性的影响,并考察了胰岛素的释放动力学以及释放形式。在pH 7.4的PBS溶液中,胰岛素-聚电解质纳米粒子存在初始突释现象,但是多层膜对胰岛素确实具有一定的缓释效果。这一效果随着吸附层数的增加而增强,这主要是由于多层膜位阻的增加与溶胀的减小。胰岛素以自由分子的形式从这些纳米粒子中释放。
对于不易通过盐析法沉淀的超氧化物歧化酶(SOD),其纳米聚集体通过聚合物沉淀法获得。SOD与透明质酸(HA)在一定pH的盐溶液中结合,从而形成SOD-HA聚集体。本文采用准弹性光散射法与浊度滴定法研究了SOD与HA的结合过程,并采用电位滴定法和浊度滴定法详细考察了这一过程中二者之间静电相互作用的变化。随着pH的降低,SOD-HA混合液经历无相互作用、可溶性复合体、聚集体及其重新溶解四个阶段。静电相互作用是推动SOD与HA结合的主要因素。二者发生静电结合的必要条件是SOD结合H<+>的增加量小于HA结合H<+>的减少量。本文还考察了溶液的pH、NaCl浓度、SOD浓度和HA浓度对SOD回收率的影响,并确定了制备SOD-HA聚集体的最优条件。目前,已经获得粒径为200~400nm的不规则SOD-HA纳米聚集体。
采用EMPA和WSC在这些纳米聚集体上交替吸附,以制备SOD-HA-聚电解质(SHP)纳米粒子,其性质通过SEM、激光粒度分析仪、ζ电位仪等进行表征。目前已经得到聚电解质多层膜最多为8层的SHP纳米粒子,粒径为200~460nm,多为不规则球体,载药量约为45%,SOD活性保留70%以上。本文考察了培养液的pH以及聚电解质层数对EPMA/WSC多层膜渗透性的影响,研究了SOD的释放动力学以及释放形式,并推测出SOD的释放机理。SHP纳米粒子存在初始突释现象,但EPMA/WSC多层膜对SOD的缓释效果比较好。SOD的缓释效果随着吸附层数的增加而增强。这与多层膜位阻的增大以及溶胀的减小密切相关,SOD-HA纳米聚集体对SOD的缓释作用也是重要原因之一。一部分SOD以自由分子的形式从SHP纳米粒子中释放,另一部分则以SOD-HA可溶性复合体的形式释放。SOD的释放过程同时受SOD扩散过程和多层膜解体过程的控制。
总之,各种蛋白质固体颗粒都可以通过生物可降解聚电解质的层层吸附法进行直接包封。与其它纳米胶囊化技术相比,层层吸附法包封蛋白质药物由于需要反复的吸附和离心而比较耗时,但它能够避免苛刻的制备工艺,不使用有机溶剂,且不需要高温,这将使蛋白质活性的潜在损失最小化。通过改变吸附循环次数可以在纳米尺度调节多层膜的厚度及其渗透性,因而蛋白质的释放行为可以控制。这种方法制备的纳米粒子包封率较高,同时载药量也较高。含胰岛素的纳米粒子有望作为治疗糖尿病的静脉注射用缓释制剂。含SOD的纳米粒子则可作为治疗类风湿性关节炎等疾病的静脉注射用缓释制剂。