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轮状病毒是一种导致婴幼儿及幼龄动物肠道感染的病原体,目前尚无治疗轮状病毒的有效药物,接种疫苗仍是预防轮状病毒性胃肠炎暴发的重要措施。在轮状病毒感染初期可在胞浆中观察到病毒质,接着进行轮状病毒的包装与复制过程,非结构蛋白2（nonstructural protein 2,NSP2）和非结构蛋白5（nonstructural protein 5,NSP5）是组成病毒质样结构的最小单位,NSP2蛋白在病毒质形成、基因组包装与复制的初始阶段发挥重要作用,但其关键结构域对病毒质形成及病毒复制的影响目前尚不清楚。利用反向遗传系统研究NSP2蛋白关键位点或结构域对病毒质形成的影响,为轮状病毒新药和疫苗的研制提供参考。本研究构建了重组质粒p LVX-IRES-Puro-T7 RNAP,并将其与辅助质粒共转染293T细胞,收获慢病毒后接种BHK-21细胞,慢病毒感染将T7 RNAP基因和嘌呤霉素抗性引入BHK-21细胞,用嘌呤霉素筛选细胞,以获得稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞。原核表达NSP2基因编码区全序列,纯化重组蛋白,并与ISA206佐剂乳化免疫豚鼠,制备豚鼠抗NSP2多克隆抗体。阅读大量文献预测NSP2上可能与病毒质形成相关的位点,根据突变位点构建重组突变质粒p T7-NSP2-H225、p T7-NSP2-H225A、p T7-NSP2-784-820和p T7-NSP2-K188AH221AH225A。利用轮状病毒14质粒反向遗传系统共转染BHK-T7细胞拯救重组突变病毒。利用RT-PCR检测重组病毒中NSP2和NSP5蛋白的表达。实时定量PCR方法定量突变病毒VP6基因表达量的差异。因病毒质出现在病毒感染初期,故在重组病毒感染细胞后4 h和8 h,采用间接免疫荧光法检测病毒质的形成情况。用Reed-Muench法测定重组病毒的TCID50以检测突变体病毒在毒力上的差异。实验结果成功获得抗嘌呤霉素的稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞,RT-PCR结果表明该细胞可在不同代次稳定表达T7 RNAP基因。成功制备抗NSP2多克隆抗体,间接ELISA检测多抗效价>1:8 000。通过反向遗传系统获得的重组病毒分别命名为wt r SA11、mu r SA11-NSP2-H225、mu r SA11-NSP2-H225A、mu r SA11-NSP2-784-820和mu r SA11-NSP2-K188AH221AH225A。获救的重组病毒提取总RNA,反转录后分别用NSP2和NSP5特异性引物扩增均可得到目的条带。相对荧光定量检测突变病毒之间表达量的差异显示,与wt r SA11相比,突变病毒mu r SA11-NSP2-H225、mu r SA11-NSP2-H225A、mu r SA11-NSP2-784-820和mu r SA11-NSP2-K188AH221AH225A的VP6相对表达量分别为79.00%、39.78%、46.65%和53.58%,均有一定程度的下降,t检验中mu r SA11-NSP2-H225与wt r SA11相比差异不显著,mu r SA11-NSP2-H225A、mu r SA11-NSP2-784-820和mu r SA11-NSP2-K188AH221AH225A与wt r SA11相比差异显著。在病毒包装与复制初期,利用间接免疫荧光检测NSP2表达及病毒质形成情况,突变体病毒绿色荧光灶少于野生型,突变体病毒病毒质形成及病毒复制延迟。TCID50验证突变病毒在毒力上的差异,wt r SA11、mu r SA11-NSP2-H225、mu r SA11-NSP2-H225A、mu r SA11-NSP2-784-820和mu r SA11-NSP2-K188AH221AH225A病毒TCID50分别为10-3.86、10-3.8、10-3.42、10-2.61和10-1.61,病毒滴度的差异表明其突变位点对于病毒的复制产生了不同的影响。综上所述,与野生型病毒相比,突变体病毒mu r SA11-NSP2-H225A、mu r SA11-NSP2-784-820和mu r SA11-NSP2-K188AH221AH225A展现出的病毒质形成延迟、病毒复制延迟、VP6相对表达量降低以及病毒滴度下降表明该位点在病毒包装复制中的重要性。本研究对阐明NSP2蛋白对轮状病毒包装与复制的影响具有重要意义,为新型轮状病毒药物和疫苗的研制提供了新的途径。