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脊椎动物Pax1和Pax9基因是参与咽区发育过程的重要转录因子,与其它咽区发育相关基因Eya1、Six1和Tbx1等在咽内胚层构成复杂的调控网络。文昌鱼Pax1/9基因从神经胚期至幼体期在咽内胚层一直有强烈的表达信号,但Pax1/9基因具体参与文昌鱼咽区何种结构的发育以及与咽区相关基因之间的调控关系有待研究。本文利用TALEN基因编辑技术敲除文昌鱼Pax1/9基因,通过F0及F1代突变类型检测和基因型鉴定,成功获得含有Pax1/9纯合突变的F2代胚胎及幼体。光学显微镜观察及石蜡切片结果显示,Pax1/9-/-在三鳃裂幼体时期仅出现裂口较小的第一鳃裂,而第二鳃裂和第三鳃裂则完全消失,纯合突变体不能进食,受精后13天全部死亡,说明Pax1/9基因是文昌鱼正常发育必不可少的调控因子。原位杂交检测发现,Pax1/9-/-中Eya和Six1/2基因在第一鳃裂原基处的表达信号减弱,而第二鳃裂原基处的表达完全消失,Tbx1/10基因在第二和第三咽弓处的表达也完全消失,以上结果表明文昌鱼Pax1/9基因可能通过调控Eya、Six1/2和Tbx1/10基因的表达参与文昌鱼第一鳃裂的发育和第二、第三鳃裂的形成。另外,与文昌鱼内柱器官的标记基因Nkx2.1在Pax1/9-/-中表达量降低,内柱结构形态异常,暗示Pax1/9基因可能参与文昌鱼内柱的发育。为了进一步探究Pax1/9参与咽区发育调控的机制,本文分别注射了 Pax1/9 mRNA、Six1/2mRNA、Eya mRNA和Tbx1/10 mRNA进行Pax1/9纯合突变体的挽救实验。结果显示,注射Pax1/9mRNA和Six1/2mRNA的胚胎在三鳃裂幼体时期均出现身体两侧各有一口的对称表型,第一鳃裂裂口恢复正常,而第二、三鳃裂仍然消失。而注射Eya mRNA和Tbx1/10 mRNA的实验组均没有发现挽救表型,原位杂交检测进一步证实了表型观察的结果。由此推测第一鳃裂与第二、三鳃裂的发育机制有所不同,Pax1/9基因在过量表达时可能被激活了文昌鱼另一条调控左右不对称发育的通路。文昌鱼是进化发育生物学领域良好的研究材料。作为一种新的模式动物应用,实验中尚缺少必要的分子生物学工具。利用热休克蛋白Hsp70启动子在温度刺激下诱导目的基因大量表达的技术,已广泛地应用到多种模式动物中,但在文昌鱼中尚未得到应用。本文首先设置了不同的热激条件,在4细胞期、128细胞期、囊胚晚期、原肠中期和3体节时期分别热激,根据胚胎发育情况初步确定了不同时期的热激条件,检测不同时期在热激后内源性Hsp70基因的表达。RT-qPCR结果显示,在囊胚晚期及之后的时期热激,Hsp70基因在热激后1h内表达量急剧升高,5 h后下降至正常水平。而在4细胞时期热激却没有引起Hsp70基因的大量表达。进一步将4细胞时期热激的温度从31 ℃升高至33 ℃,热激时间为30 min,并在囊胚晚期33℃也热激30min,RT-qPCR检测发现内源性Hsp70基因在囊胚晚期热激后大量表达,而在4细胞时期热激仍没有明显变化,结果表明4细胞期胚胎在温度刺激下不能产生应激反应。随后在囊胚晚期之前(包括囊胚晚期)的6个时期在33 ℃热激30 min,发现256细胞期的胚胎开始对温度刺激产生应激反应。原位杂交检测和石蜡切片结果显示,热激后1个小时,Hsp70基因表达于胚胎各个胚层,而在表皮外胚层的表达信号更强。为检测外源Hsp70启动子在文昌鱼体内的活性,我们分别注射了以热启动子和报告基因重组的表达载体Hsp70::mCherry和Hsp70::LacZ,分别在囊胚晚期、原肠中期和3体节时期热激,2 h后可观察到强烈的红色荧光蛋白的表达和LacZ基因的表达信号,说明外源Hsp70启动子在文昌鱼体内具有高活性。此外,还分别注射了重组质粒Hsp70::Vg1和Hsp70::Cer,以检测文昌鱼Hsp70启动子的应用效果。热激后Vg1基因大量表达,幼体出现口呈两侧对称、鳃移向腹侧、口只在右侧等异常表型,而注射HspP70::Cer的幼体则出现无口、鳃形态异常等,由此推测Vg1和Cer可能参与文昌鱼左右不对称的建立机制,并具有相反的功能。综上,本文分析了内源性Hsp70基因的特性,并将热启动子诱导系统成功地应用到文昌鱼的基因功能研究中。