Class C1 Decoy ODN 联合Smad3 Decoy ODN抑制活化的大鼠肝星状细胞中TGF-β信号的实验研究

来源 :三峡大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:djs4520345
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目的:肝星状细胞(HSC)的活化是肝纤维化过程中的一个关键环节。TGF-β信号通路在肝纤维化过程中发挥着关键作用。HES1的蛋白表达与活化的肝星状细胞呈正相关关系,它所属的一类转录因子能与DNA结合序列class C(CACGNG)结合。通过转录因子圈套策略(Decoy ODN)筛选出能抑制TGF-β信号通路的class C Decoy ODNs,来抑制HSC的活化。另外,将有效的class C Decoy ODNs与Smad3 Decoy ODN联合作用活化的肝星状细胞,观察对TGF-β信号通路的抑制作用能否更好。  方法:  (1)通过生物信息学技术预测分析TGF-β信号通路中TGF-β及其下游靶基因(如COLΙα1、TIMP1、α-SMA等)的启动子区与class C序列匹配程度;  (2)通过荧光素酶报告基因分析法检测class C Decoy ODNs对TGF-β信号通路中TGF-β及其下游靶基因启动子活性的影响;  (3)通过Western blot方法进一步验证class C Decoy ODNs对TGF-β信号通路中TGF-β及其下游靶基因在蛋白水平的影响;  (4)通过荧光素酶报告基因分析法检测能影响TGF-β及其下游靶基因启动子活性的Decoy ODNs组合。  结果:  (1)通过生物信息学分析发现TGF-β及其靶基因COLΙα1、TIMP1、α-SMA以及HES1的启动子上有class C序列的存在,而COLΙα2的基因启动子区内没有class C序列存在;  (2)通过荧光素酶报告基因分析法检测出能下调TGF-β信号通路中TGF-β及其下游靶基因启动子或增强子水平的class C Decoy ODNs,其中包括class C1 Decoy ODN、class C2 Decoy ODN、class C3 Decoy ODN以及class C4 Decoy ODN;  (3) Western blot进一步验证发现4种class C Decoy ODNs中,对TGF-β及其靶基因影响范围较广的是class C1 Decoy ODN,下调效果相对较好的是class C2 Decoy ODN,而class C3 Decoy ODN与class C4 Decoy ODN对其影响效果差;  (4)通过荧光素酶报告基因分析法筛选出一定程度上能影响TGF-β及其下游靶基因启动子活性的Decoy ODN组合,包括class C1 Decoy ODN与Smad3 Decoy ODN的组合,以及class C2 Decoy ODN与Smad3 Decoy ODN的组合,而且第一种组合比第二种组合对TGF-β及其下游靶基因启动子活性下调作用好。  结论:Class C1/2 Decoy ODN能通过抑制TGF-β信号来抑制大鼠肝星状细胞的活化。Class C1 Decoy ODN联合Smad3 Decoy ODN,能够下调活化的大鼠肝星状细胞中,TGF-β应答元件TRE活性,以及TGF-β靶基因TIMP1和α-SMA启动子的活性。说明,Class C1 Decoy ODN联合Smad3 Decoy ODN能抑制活化的大鼠肝星状细胞中TGF-β信号。
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