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哺乳动物精子中二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）是一种线粒体基质酶,亦是精子繁殖能力标记蛋白,其表达量的变化直接或间接影响动物精子的受精潜能。此外,蛋白翻译后修饰的变化也逐渐成为哺乳动物精子繁殖标记的研究热点。然而,精子中DLD是否发生酪氨酸磷酸化修饰的变化,DLD酪氨酸磷酸化与精子细胞内能量代谢和ATP水平是否存在关联性,相关研究甚少。尤其DLD酪氨酸磷酸化可逆性变化是否引起精子繁殖能力发生改变,其相关作用机制研究尚未见报道。因此,本研究利用重金属离子及小分子抗氧化剂作为小鼠精子DLD酪氨酸磷酸化可逆性变化的诱导因子,以DLD酪氨酸磷酸化为切入点,分析精子活力、能量代谢与DLD酪氨酸磷酸化修饰可逆性变化的相关性,探讨DLD蛋白酪氨酸磷酸化修饰的变化引起小鼠精子繁殖功能发生改变的分子机制,为进一步研究蛋白翻译后修饰的变化影响精子繁殖能力的分子机理,以及发掘家畜精子繁殖能力相关生物标记蛋白提供理论依据。本研究主要做了以下三个方面的工作:1.利用蛋白免疫印迹技术（WB）分析不同浓度镉离子诱导小鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化修饰变化状况。结果证实,当镉离子浓度增加到5μM时诱导分子量约为55 kDa蛋白发生酪氨酸磷酸化。采用双向凝胶电泳结合蛋白免疫印迹技术（TD-WB）,对该蛋白进行了鉴定,结果显示该特异性修饰蛋白为DLD。加入cAMP/PKA信号通路PKA抑制剂H-89和Ca2+级联信号通路调节因子W7和KN-93后,DLD酪氨酸磷酸化修饰没有发生变化,说明镉离子诱导DLD酪氨酸磷酸化修饰不遵循获能相关的cAMP/PKA信号通路和Ca2+级联信号通路。同时,获能调节因子HCO3-和BSA一起培养小鼠精子时,DLD不会发生酪氨酸磷酸化,提示DLD的酪氨酸磷酸化不参与小鼠精子获能。此外,采用DLD抗体结合免疫沉淀技术富集DLD蛋白,然后进行了酪氨酸磷酸化修饰检测,结果显示镉离子确实诱导DLD发生酪氨酸磷酸化修饰,而BSA可以抑制DLD的酪氨酸磷酸化,进一步验证了镉离子诱导DLD蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰的正确性。细胞的免疫荧光（IF）结果显示,镉离子处理后小鼠精子中段的荧光强度显著增强,镉离子和BSA一起处理后,中段荧光强度未发生显著变化,而线粒体恰位于小鼠精子中段,DLD又是一种线粒体蛋白,进一步验证了鉴定的DLD的正确性。2.DLD是三羧酸循环（TCA）中α-酮戊二酸脱氢酶复合体和丙酮酸脱氢酶复合体的第三组件,TCA过程中产生的NADH直接参与线粒体呼吸产能,而精子细胞内的ATP直接影响精子活力。蛋白酪氨酸磷酸化是一种重要的酶活性共价修饰方式,而DLD发生酪氨酸磷酸化时是否影响精子代谢以及活性机能?本研究结果显示,DLD发生酪氨酸磷酸化时,其脱氢酶活性显著降低（P<0.05）。细胞内NADH水平、线粒体产生的ATP水平和小鼠精子能动性（MOT）、前进性运动速率（PRO）、平均曲线运动速度（VCL）及平均直线运动速度（VSL）均显著降低（P<0.05）。然而,当5 mg/mL BSA和10μM镉离子一起培养小鼠精子抑制DLD发生酪氨酸磷酸化时,与单独10μM镉离子处理组相比,DLD脱氢酶活性、NADH水平、线粒体产生的ATP水平和精子活力各项参数均显著增加（P<0.05）。此结果提示,DLD的酪氨酸磷酸化修饰可能抑制其脱氢酶活性,阻碍TCA循环,降低线粒体能量代谢,从而影响小鼠精子活力及其繁殖能力。3.蛋白修饰的可逆性是其主要特点之一,尤其是酶蛋白磷酸化修饰发生可逆性变化后直接影响其自身的生理活性。镉离子诱导DLD发生酪氨酸磷酸化修饰是否存在可逆性?因此,本研究利用小分子抗氧化剂维生素C（Vc）和N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为小鼠精子DLD酪氨酸磷酸化可逆性变化的诱导因子,验证酪氨酸磷酸化DLD发生可逆性变化后其功能如何。结果显示在20 mM Vc或8 mM NAC的诱导下酪氨酸磷酸化DLD会发生脱磷酸化,从而恢复其脱氢酶活性、细胞内NADH水平、ATP水平以及精子活力。结果提示酪氨酸磷酸化DLD存在可逆性,且酪氨酸磷酸化和脱磷酸化可以作为DLD功能失活和复活的分子标记。同时,进一步研究证实Vc和NAC引起的DLD脱磷酸化并不是由于其抗氧化特性,可能通过与镉离子结合改变酪氨酸激酶与磷酸酶的平衡,进而诱导DLD脱磷酸化。综上所述,小鼠精子中,DLD的酪氨酸磷酸化修饰受重金属离子调控,且DLD的这种磷酸化修饰不参与精子获能,也不遵循cAMP/PKA信号通路和钙离子级联信号通路;发生酪氨酸磷酸化后DLD活性降低,进而影响精子能量代谢、ATP水平和活力;在小分子抗氧化剂Vc和NAC诱导因子作用下,酪氨酸磷酸化DLD发生脱磷酸化,而脱磷酸化促进小鼠精子DLD活性的复活;DLD酪氨酸磷酸化和脱磷酸化可以调节DLD活性,酪氨酸磷酸化修饰和脱磷酸化可以作为DLD功能失活和复活的分子标记,直接参与小鼠精子细胞内线粒体能量代谢、NADH水平、ATP水平,进而调节精子活力和功能。