【摘 要】
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干旱、高盐、低温等逆境胁迫是影响植物生长发育和品质形成的主要环境因素。DREB是植物中特有的一类转录因子,在植物的逆境胁迫应答中发挥着非常重要的作用。本研究利用生物化学和分子生物学的手段从普通烟草品种K326 （Nicotiana tobaccum）中分离克隆到新的DREB转录因子基因,对其功能进行了初步探讨,有助于进一步揭示DREB家族的调控机制,为以后利用其改良烟草综合抗逆性提供了研究基础。本
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干旱、高盐、低温等逆境胁迫是影响植物生长发育和品质形成的主要环境因素。DREB是植物中特有的一类转录因子,在植物的逆境胁迫应答中发挥着非常重要的作用。本研究利用生物化学和分子生物学的手段从普通烟草品种K326 （Nicotiana tobaccum）中分离克隆到新的DREB转录因子基因,对其功能进行了初步探讨,有助于进一步揭示DREB家族的调控机制,为以后利用其改良烟草综合抗逆性提供了研究基础。本论文通过Genome Walking的方法,从烟草中克隆到四个DREB-Like基因,分别命名为NtDREBI、NtDREB2、NtDREB3、NtDREB4。序列分析发现它们具有典型的AP2/EREBP家族结构特征,进化树分析结果表明四个基因均属于DREB亚族,NtDREBI与油菜BnDREB2-1同源性很高,NtDREB2、NtDREB3和NtDREB4与番茄LeCBF1和烟草NtACRE111B同源性较强。ERF/AP2结构域比对发现,NtDREB4在ERF/AP2的第11位氨基酸残基处是Asn,而其它的转录因子在该位则是保守的Asp和Gly。基因表达模式分析表明四个基因都强烈的受冷胁迫诱导,同时NtDREB4还受干旱、高盐和乙烯诱导。酵母单杂交结果显示,NtDREBI能够特异性结合DRE元件并激活下游基因表达; NtDREB2、NtDREB3只能结合DRE元件不具有激活功能;而NtDREB4却不能与DRE元件结合。将NtDREBI与BnDREB2-1,NtDREB1A与AtDREB1A的氨基酸序列进行比对发现,处于转录调控区的第148位氨基酸有所不同,采用定点突变方法进一步研究表明DREB1A类转录因子的第148位氨基酸残基与其邻近氨基酸残基的相互作用对调控转录激活功能起关键作用。利用构建的PDI融合表达系统,通过Ni-NTA提取并纯化了高度可溶的NtDREB-PDI融合蛋白,进行凝胶滞留分析表明: NtDREB2和NtDREB3能够特异性的结合DRE元件,而NtDREB4既不能与DRE元件结合也不能与GCC box元件结合。由于NtDREB4的ERF/AP2结构域的第11位氨基酸残基与其它转录因子有差别,因而通过定点突变和酵母单杂交结果表明ERF/AP2结构域中loop上的第11位的甘氨酸和天冬氨酸对于DREB结合DRE元件及维持ERF/AP2结构域的稳定构象是必需的。
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