动物药是中医药临床应用的三大组成之一,疗效确切,临床应用广泛。限于动物药自身化学组成复杂,分析难度大,与植物药相比,其基础研究薄弱,质量控制技术和水平亟待加强。Totality-of-the-evidence(TOE),“证据链完备性”,是美国FDA《工业界植物药研发指南》推荐用于活性物质不清晰的植物药的质控思路,强调明确大类成分组成和从源头基原品种、采收加工到成品等过程的全成分质控,特别适合用于当前动物药的质量控制。蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B.melanostictus Schneider耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物,是国务院颁布的需要特殊管理的28种毒麻中药品种之一,也是42种国家重点保护的(二级)野生动植物药材品种。作为分泌物加工品,蟾酥缺乏平常药材(或饮片)固有的基原动物的外观形态,质量控制存在特殊困难。因此,本研究以蟾酥为例探讨“TOE”思路下的动物药质量控制内涵研究。蟾酥主要包括以蟾毒配基和吲哚生物碱为主的小分子和蛋白类物质,前期针对小分子物质在基原品种间的差异性以及初加工过程中的变化进行了研究,本论文采用Nano LC-MS/MS对其中蛋白类成分进行研究;综合前期小分子研究和本部分蛋白研究结果,建立基于整体质量控制策略的蟾酥药材和饮片质量标准。主要研究内容和结果如下:1、蟾酥药材蛋白组成分析通过提取溶剂种类、组成和p H值的考察,建立蟾酥药材总蛋白的提取方法,采用Bradford法测定了不同批次蟾酥药材总蛋白含量,47批干品蟾酥中总蛋白含量在6.90-28.3%。采用蛋白组学相关技术比较法定基原品种中华大蟾蜍和黑眶蟾蜍及近缘易混淆品花背蟾蜍和华西蟾蜍来源的蟾酥的蛋白组成差异性:(1)SDS-PAGE法对不同基原蟾酥样品进行分析,其蛋白条带具有明显差异。中华大蟾蜍、华西蟾蜍和花背蟾蜍在40-55 KD具有明显主条带,黑眶蟾蜍蟾酥在此处无明显条带,并且后者在>180 KD范围内有条带。中华大蟾蜍和华西蟾蜍之间,前者在130KD处无条带,后者此处条带清晰。中华大蟾蜍和花背蟾蜍之间,前者在25-35 KD条带清晰,后者在该范围无条带。(2)基于纳升液质联用技术,对4个基原(中华大蟾蜍、黑眶蟾蜍、华西蟾蜍和花背蟾蜍)的8个蟾酥样品进行差异蛋白分析,基于Proteome Discoverer 2.2平台检索cane toad.v2.2.proteins.fasta数据库,共鉴定到1357个蛋白,Gene Ontology基因功能注释和KEGG富集分析显示,鉴定到的蛋白包括氧化还原酶、水解酶和转运蛋白等,参与糖酵解、转运和翻译等多种生物学过程。通过统计学分析,法定基原(中华大蟾蜍、黑眶蟾蜍)区别于近缘易混淆品种的特有蛋白有49个、中华大蟾蜍和华西蟾蜍蟾酥区别于其它两个基原蟾酥的特有蛋白有26个、中华大蟾蜍蟾酥区别于其它三个基原蟾酥的特有蛋白有22个、黑眶蟾蜍蟾酥区别于其它三个基原蟾酥的特有蛋白有82个、花背蟾蜍蟾酥区别于其它三个基原蟾酥的特有蛋白有5个,华西蟾蜍蟾酥区别于其它三个基原蟾酥的特有蛋白有60个。根据差异蛋白鉴定时的高可信度肽段,得到各基原间相互区分的特征肽段:黑眶蟾蜍区别于其它三个基原的特征肽段ILKDQGYSTGIIGK,华西蟾蜍区别于其它三个基原的特征肽段QLLAGGMAGAVSR,中华大蟾蜍区别于黑眶蟾蜍的特征肽段SLLTGPSQLK,中华大蟾蜍区别于华西蟾蜍的特征肽段TGAFDWSHVAK,黑眶蟾蜍区别华西蟾蜍的特征肽段FLENLNNFVK,华西蟾蜍区别黑眶蟾蜍的特征肽段TTDMMFGGK、QVVEEPSPQLPAGK、MIGPFFDTLSTK、ITPADSQLQR、DLTAEQAAER和LVDNTEDWHPR,和黑眶蟾蜍区别花背蟾蜍的特征肽段YIAVIIHPDQK。利用SIEVE 2.0软件,导出质谱数据的质荷比、保留时间和峰面积,结合PCA和OPLS-DA分析,筛选得到不同基原间的特征离子:中华大蟾蜍(530.3290-15.40)与华西蟾蜍(964.5004-19.63、352.5574-18.11、1055.6564-18.31和527.3066-20.87)、中华大蟾蜍(461.2529-66.23和622.8214-65.24)与花背蟾蜍、黑眶蟾蜍(948.0197-65.76、1269.6597-67.10、512.3225-52.24、1269.6581-64.98和644.3872-40.02)与华西蟾蜍、黑眶蟾蜍(47个特征离子)与花背蟾蜍、华西蟾蜍(34个特征离子)与花背蟾蜍、花背蟾蜍与其它三个基原(8个特征离子)。(3)采用同一基原的鲜浆样品,考察烘干(105℃、80℃、60℃)、减压干燥(60℃)、冷冻干燥和阴干等不同干燥方式对蟾酥蛋白成分的影响。冷冻干燥样品加工前后颜色无明显变化,其它几种干燥方式样品加工后颜色有不同程度加深;蛋白含量测定结果为冷冻干燥>减压干燥>阴干>80℃烘干>60℃烘干>105℃烘干;SDS-PAGE分析显示105℃烘干样品蛋白条带比其它样品条带明显减少,60℃烘干样品条带数目与其它样品相同但条带颜色较浅,其它3种干燥方式没有明显区别。不同分析方法均提示蛋白成分随温度升高产生明显变化,推测部分蛋白在较高温度下发生降解。2、蟾酥药材和饮片质量标准的完善和提高综合前期小分子研究基础和本论文大分子的研究结果,考虑到标准提升要循序渐进,以兼顾当前中成药生产实际,现阶段仍以小分子蟾毒配基作为质量控制指标。在前期定性、定量分析方法的基础上,构建改进的蟾酥药材和饮片整体质量控制方法和标准,包含采用优化的薄层鉴别方法进行定性鉴别;采用【含量测定】项下的色谱条件建立HPLC特征图谱;完善一测多评法的相对校正因子,并将其用于38批蟾酥药材中蟾毒配基的含量测定,制定合理含量限度。在此基础上,参照药材拟修订方法,对不同批蟾酥粉进行【性状】、【鉴别】(薄层鉴别)、【特征图谱】、【检查】(水分)和【含量测定】等检测项研究,起草蟾酥粉的质量标准。具体为:(1)对【薄层鉴别】和【含量测定】项下的供试品溶液制备方法进行简化和统一,取【含量测定】项下的供试品溶液浓缩5倍作为【薄层鉴别】供试品溶液制备方法。(2)采用【含量测定】项下的色谱条件,建立以日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基共5个蟾毒配基类成分特征峰的HPLC特征图谱。(3)在前期一测多评法研究基础上,采用不同的计算方法(多点校正法和斜率法)计算不同检测波长对相对校正因子的影响。开展同一实验室不同操作者和不同实验室之间相对校正因子验证实验,确定华蟾酥毒基对日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵和蟾毒配基的相对校正因子分别为0.942、1.03、0.923和1.04。采用上述相对校正因子计算的38批蟾酥药材中5种蟾毒配基的总量与外标法测定结果无显著性差异。(4)根据38批蟾酥样品中5种蟾毒配基的总量,结合商品蟾酥质量现状,建议以干燥品计,5种蟾毒配基之和不低于9.0%。