【摘 要】
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甲醛脱氢酶(FDH)作为含锌中等链醇脱氢酶(ADH)的家庭成员之一广泛存在于原核和真核生物中。该酶能利用NAD+作为辅酶,将有毒的甲醛氧化。目前发现除了恶臭假单胞菌甲醛脱氢酶
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甲醛脱氢酶(FDH)作为含锌中等链醇脱氢酶(ADH)的家庭成员之一广泛存在于原核和真核生物中。该酶能利用NAD+作为辅酶,将有毒的甲醛氧化。目前发现除了恶臭假单胞菌甲醛脱氢酶外,其余的甲醛脱氢酶均需要谷胱甘肽参与甲醛的氧化过程。为了能对其他物种谷胱甘肽非依赖性甲醛脱氢酶进行结构和功能研究,需要建立大肠杆菌表达体系实现具有生物酶活性的甲醛脱氢酶的可溶性表达和高度纯化。铜绿假单胞菌(即绿脓杆菌,Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性致病菌,可引起人体感染。该菌的FDH与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) FDH具有高度序列相似性。本研究通过分子克隆技术构建铜绿假单胞菌甲醛脱氢酶基因表达载体,利用共表达技术,通过分子伴侣GroES、GroEL和Tig与甲醛脱氢酶在大肠杆菌中共表达,减少了重组蛋白包涵体的形成,显著提高了可溶性铜绿假单胞菌FDH在大肠杆菌中的表达水平。通过三步色谱柱分离纯化方法,可从1L培养产物中得到约3.2mg的高纯FDH重组蛋白。质谱分析、蛋白质晶体结构解析以及酶活动力学实验均证明了铜绿假单胞菌FDH蛋白在分子伴侣共表达作用下,在大肠杆菌中能够进行正确折叠,形成了具有生物学活性的重组蛋白。
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