纳米银核酸功能化探针在miRNA-21检测中的研究与应用

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银纳米粒子作为易于合成和修饰的等离子体纳米材料之一,具有独特且优越的光学性质,如高的摩尔消光系数、表面增强拉曼散射效应、金属表面增强荧光效应,局域表面等离子体共振效应等。银纳米粒子在许多生物标志物以及药物、污染物等的检测中发挥出良好的效果。miRNAs又称为微小RNA,是一种同源性高、序列短、易于降解的内源性非编码的单链RNA,研究证明miRNAs与肿瘤的发生和发展具有密切的相关性,不同种类的miRNAs能够作为原癌基因或者抑癌基因发挥生命调节作用。因此准确、灵敏地检测miRNAs对肿瘤的早期诊断和治疗具有重要价值。本论文以在多种癌症细胞内高水平表达的miRNA-21作为检测对象,基于荧光偏振检测,荧光成像及检测等方法,设计了一系列银纳米粒子探针,并将其用于miRNA-21的定量检测以及细胞内成像分析。具体研究内容包括:(1)发展了一种基于Ag10NPs与链取代反应共同发挥作用的高灵敏miRNA-21分析检测方法,能够在标准体系以及真实生物样品中实现miRNAs的快速、准确和灵敏检测。它是一种恒温、不需要酶辅助的检测方法,克服了其他检测方法步骤复杂、反应时间长、需要周期性加热等缺点。检测探针由Ag10NPs和数对修饰于其上的互补核酸链组成,一条5’端带有巯基的核酸链(称为1-SH)首先与另外一条带有荧光基团的核酸链(称为2-FAM)互补结合并连于Ag10NPs上,通过与目标检测物miRNA-21之间的链取代反应将2-FAM置换下来形成miRNA-21+2-FAM的双链结构,随后与另外加入的“燃料”核酸链(称为3-fuel)接着进行链取代反应使得miRNA-21进入下一个循环链取代反应过程。利用了Ag10NPs的质量增强效应与金属表面增强荧光效应以及循环链取代反应系统,通过miRNA-21作为引发剂,实现了不对称放大效果,检测限可低至93.8 p M,检测时间可缩短至40 min,并且在生物样品中具有一定的抗干扰能力,有望进一步在血液、尿液等复杂样本检测中发挥作用。(2)设计了一种基于十面体纳米银的细胞内成像与定量检测miRNA-21的单细胞水平的荧光探针。纳米银上连有的数对互补的核酸双链,标记有AF488基团的核酸A链通过碱基互补配对原则与带有Cy3标记的核酸B链相连,构成一套荧光共振能量转移体系。这种纳米银探针与目标检测物miRNA-21反应后使得AF488基团的荧光得以恢复,通过纳米银的表面增强荧光效应,能够实现单颗粒荧光成像以及单细胞水平的miRNA-21动态分析与检测。总体而言,该传感器能够为miRNA-21的胞内检测与成像提供一种简单可行的办法,也有望应用于其他生物标志物的成像与特异性检测。
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