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背景&目的肿瘤的缺氧微环境是大部分实体肿瘤的特征之一,缺氧能够促进以及稳定缺氧诱导因子（HIFs）,特别是HIF-1α的表达,从而激活上皮-间充质转化（epithelia-mesenchymal transition,EMT）相关转录因子的表达并诱导EMT的发生及癌细胞的侵袭和转移。HIF-1α亚基是HIFs主要的活性基团[1],受到胞内氧气水平的调节。HIF-1α可通过多种通路调控EMT转化。EMT被认为是胚胎发育和肿瘤形成过程中形态变化的关键事件,肿瘤的EMT对人类癌细胞的侵袭和转移起着重要作用。MiR-200家族是控制细胞EMT发生的关键因子,迄今为止的报道发现miR-200/ZEB参与多个通路抑制多种癌症的EMT、肿瘤迁移、侵袭和转移[2-5]。我们的前期研究发现转录因子Achaete Scute-like 2（Ascl2）可通过抑制miR-200家族的转录,抑制miR-200s/ZEB轴对结直肠癌EMT的阻遏作用[6]。Ascl2是一个在结直肠癌（CRC）细胞EMT调节过程中起关键作用的因子,且在许多报道中被证实受到缺氧的影响。YES相关蛋白1（YAP1）是Hippo途径的转录共激活子,其在器官生长,组织修复和肿瘤生成,进展和转移中起重要作用。YAP1在很多癌症中检测到表达增加,包括食道癌,胃癌和结直肠癌[7]。AXL、CTGF与CYR61作为YAP1下游靶分子[8]在促进肿瘤转移方面起到重要作用。我们主要研究了HIF-1α/Ascl2/miR-200b轴如何调节CRC细胞中EMT的发生,以及YAP1对CRC患者肿瘤预后和CRC细胞生物学行为改变的影响。从而为结直肠癌的防治提供了新思路。方法1.HIF-1α通过Ascl2/miR-200b轴调节结直肠癌细胞EMT1.1通过分析选取50例结肠癌患者标本,包括癌组织及对应癌旁组织,利用实时定量PCR的方法检测结肠癌及癌旁组织中HIF-1α、Ascl2及miR-200b的表达,明确其临床意义。1.2 HIF-1α与miR-200b,HIF-1α与Ascl2表达的相关性分析。1.3实时定量PCR及Western blot实验检测在CRC细胞（LS2174T细胞和SW480细胞）缺氧（1%O2）期间,HIF-1α、Ascl2和EMT标志物的表达变化。1.4缺氧（1%O2）条件下,通过干扰Ascl2的合成,观察CRC细胞（LS174T细胞和SW480细胞）EMT进程的动态变化。1.5用miR-200b抑制剂转染Ascl2干扰及对照的CRC细胞（sh-Ascl2/LS174T细胞和sh-Ctr/LS174T细胞）,然后检测EMT进程的动态变化。1.6实时定量PCR及Western blot实验检测HIF-1α干扰、HIF-1α过表达条件下,CRC细胞（LS174T细胞和SW480细胞）中Ascl2、miR-200b和EMT的动态变化。2.YAP1对结直肠癌患者预后和结直肠癌细胞生物学行为的影响2.1通过分析TCGA数据库下载结直肠癌患者的相关数据,明确YAP1在肿瘤组织与正常组织表达差异,以及与远处转移的关系。2.2 YAP1与CRC预后相关性分析。2.3YAP1过表达CRC细胞株（Lv-YAP1/SW480细胞和Lv-YAP1/HT29细胞）的构建并检测YAP1过表达效率。2.4检测YAP1过表达后,Lv-YAP1/SW480细胞和Lv-YAP1/HT29细胞行为（增殖、迁移、侵袭能力）的改变。2.5迁移、侵袭实验检测过表达YAP1的CRC细胞（Lv-YAP1/SW480细胞和Lv-YAP1/HT29细胞）下游靶基因（AXL、CTGF、CYR61）干扰后细胞行为的变化。结果1.HIF-1α通过Ascl2/miR-200b轴调节结直肠癌细胞EMT1.1癌组织中HIF-1α和Ascl2的表达明显高于正常癌旁组织（P<0.01）;miRNA-200b在癌组织中的表达明显低于正常癌旁组织（P<0.01）。1.2在结直肠癌组织样本中:HIF-1α与miR-200b的表达呈显著负相关（R=-0.324,P<0.05）,HIF-1α与Ascl2的表达呈显著正相关（R=0.333,P<0.05）。1.3缺氧（1%O2）可引起HIF-1α、Ascl 2和间充质标记物（N-cadherin和ZEB1）的mRNA和蛋白表达水平上升,而上皮标记物E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平降低,促进EMT进程。1.4缺氧（1%O2）条件下,Ascl2的干扰导致了间充质标记物（N-cadherin、ZEB1）的mRNA和蛋白表达水平降低,上皮标记物E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平上升,抑制EMT进程。1.5缺氧（1%O2）降低了CRC细胞（LS174T细胞和SW480细胞）中miR-200b的表达,Ascl2的干扰升高了CRC细胞（LS174T细胞和SW480细胞）中miR-200b的表达。缺氧（1%O2）条件下,Ascl2干扰的CRC细胞（sh-Ascl2/LS174T细胞）在加入miR-200b抑制剂后,上皮标记物表达下降,间充质标记物表达上升,原本抑制的EMT进程得到促进。1.6 HIF-1α干扰促进了的CRC细胞中miR-200b的表达,抑制Ascl2表达,抑制EMT进程。缺氧（1%O2）促进了HIF-1α的表达。HIF-1α过表达促进了CRC细胞中Ascl2表达,抑制miR-200b表达,促进EMT的进程。2.YAP1对结直肠癌患者肿瘤预后和结直肠癌细胞生物学行为的影响2.1 CRC组织中YAP1表达高于正常邻近组织（P=0.002）,YAP1表达与CRC患者远处转移呈正相关（P=0.001）。2.2 YAP1表达与CRC患者的无病生存率相关（P=0.008）,并与CRC患者的总生存率相关（P=0.022）。2.4 YAP1表达与患者年龄（P=0.040）和远处转移（P=0.024）相关。2.5 YAP1过表达促进CRC细胞的增殖,侵袭和迁移。Lv-YAP1/SW480细胞和Lv-YAP1/HT29细胞的迁移和侵袭能力由AXL,CTGF和CYR61介导。结论1.HIF-1α/Ascl2/miR-200b轴可以调节CRC细胞EMT。2.YAP1通过其靶基因AXL,CTGF和CYR61影响CRC患者的预后和CRC细胞行为。