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目的:构建和筛选上调和下调NF-YA基因的病毒质粒,探讨在成骨细胞以及骨肉瘤细胞两种细胞中,NF-YA的表达差异。研究NF-YA基因是否通过改变FASN的表达,从而影响骨肉瘤细胞(HOS、U2OS)在体外的增殖、迁移和侵袭的能力。方法:(1)常规培养成骨细胞(HOB)和骨肉瘤细胞(HOS和U2-OS),分为三组,HOB、HOS和U2-OS组。通过q RT-PCR和Western blot实验,检测NF-YA的m RNA和蛋白质的表达情况。(2)将Plv/CD NF-YA慢病毒、Plv/SH NF-YA慢病毒和Plv NF-YA慢病毒质粒载体分别转染骨肉瘤细胞(HOS和U2-OS),两种细胞各分为三组,即Plv/CD组、Plv/SH组和Plv组。采用MTT法、划痕愈合实验以及Transwell侵袭实验,分别检测两种细胞Plv/CD组、Plv/SH组和Plv组的增殖、迁徙和侵袭能力;通过q RT-PCR和Western blot实验检测Plv/CD组、Plv/SH组和Plv组的NF-YA和FASN的m RNA和蛋白质的表达情况。结果:(1)在U2-OS,HOS和HOB细胞中通过q RT-PCR和蛋白质印迹法检测NF-YA的m RNA和蛋白质的表达。结果表明,在成骨细胞中NF-YA的m RNA和蛋白质的表达都明显低于U2-OS和HOS细胞。因此可以认为,NF-YA在骨肉瘤细胞(HOS、U2-OS)中表达高于成骨细胞(HOB)。(2)HOS和U2-OS细胞子分别转染Plv/CD NF-YA慢病毒、Plv/SH NF-YA慢病毒和Plv NF-YA慢病毒载体24 h。通过q RT-PCR和蛋白质印迹法实验,检测NF-YA的m RNA和蛋白质的表达水平。在骨肉瘤细胞中,转染Plv/CD NF-YA慢病毒载体的NF-YA的表达水平高于转染Plv NF-YA的慢病毒载体,而转染Plv/SH NF-YA慢病毒载体的NF-YA的表达水平明显低于转染Plv NF-YA的慢病毒载体。这些结果表明,构建的含编码NF-YA的慢病毒载体转染骨肉瘤细胞(HOS和U2-OS)是成功的。(3)在HOS和U2-OS细胞分别转染Plv/CD NF-YA慢病毒、Plv/SH NF-YA慢病毒和Plv NF-YA慢病毒载体,研究NF-YA是否促进FASN在骨肉瘤细胞中的表达。通过q RT-PCR和蛋白质印迹法实验,检测FASN的m RNA和蛋白质的表达水平。结果显示,骨肉瘤细胞FASN的m RNA和蛋白质的表达,转染Plv/CD NF-YA慢病毒高于转染Plv NF-YA的慢病毒载体。在转染Plv/SH NF-YA慢病毒的骨肉瘤细胞中,FASN的m RNA和蛋白质的表达水平低于转染Plv NF-YA的慢病毒载体。结果说明,NF-YA的过表达可以促进FASN在骨肉瘤细胞中的表达水平的提高。(4)为了阐明NF-YA表达的变化对骨肉瘤细胞恶性表型的影响,HOS和U2-OS细胞分别转染Plv/CD NF-YA慢病毒、Plv/SH NF-YA慢病毒和Plv NF-YA慢病毒载体。通过MTT实验、划痕实验和侵袭实验,分别检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果表明,细胞的增殖、迁移和侵袭能力,上调组(Plv/CD)显著高于阴性对照组(Plv),下调组(Plv/SH)明显低于阴性对照组(Plv)。表明,在体外,上调NF-YA能促进骨肉瘤细胞的恶性表型。结论:NF-YA在骨肉瘤细胞中高表达。NF-YA在骨肉瘤细胞中能够调节FASN的表达。在体外,NF-YA表达水平的变化可以改变骨肉瘤细胞的恶性表型,这为实验的进一步研究打下了基础。