基因治疗的关键技术之一是基因传输载体技术。基因载体分病毒型和非病毒型两大类,而聚阳离子是非病毒型载体中研究开发最多的一类。　　 众所周知,聚阳离子基因载体的高转染效率在有血清状态下急剧降低,这源于内外因的交互作用。内因来自载体自身内在结构导致的细胞毒性,外因来自给药后人体生理体液和血清蛋白的抑制。研究开发出优秀的可供体内应用的高效低毒的聚阳离子型非病毒载体,需要解决两大技术难点:消除外因——对抗血清的抑制作用；消除内因——降低内在结构的细胞毒性。对其进行化学改性或偶联生物活性配体等是常用分子生物学和细胞生物学实现手段。到目前为止,对抗血清抑制的聚阳离子载体能达到血清抑制程度的降低,但极少见到完全消除血清抑制和得到血清促进并显著提升的报道。　　 本研究精选已成功商用的体外高转染效率而体内应用受血清抑制而局限于体外细胞转染试剂用途的一类聚阳离子——聚酰胺-胺树枝状高分子作为化学修饰改性的基础原料,对其嫁接可作为营养用途的完全无毒的聚氨基酸多肽进行分子表面修饰,成功构建三嵌段聚酰胺-胺-聚谷氨酸-聚酰胺-胺(ALA)星射形树枝状聚合物。ALA结构精巧、合理而通过简易的有机化学手段可以实现,其具备纳米级球型星射状聚蛋白质多肽骨架,骨架内富集大量蜂窝状巢穴,ALA纳米分子球形外表面和蜂窝状巢穴内表面都挂满聚酰胺.胺树枝状高分子聚阳离子。研究证实,ALA低毒、高效、在血清存在的细胞转染试验中表现出比无血清存在时显著高得多的转染效率。与目前世界前沿本研究领域报道的聚阳离子非病毒型载体研究结果有显著而长足的进展,即本研究得到的聚阳离子基因载体的转染效率,不仅没有受到血清存在的抑制,反而受到血清存在的促进,表现出了令聚阳离子型基因载体研究界瞩目的优良的生物相容性。本研究还从分子结构水平提出了对抗血清抑制、提高生物相容性和基因转染效率的聚阳离子三维分子结构模型和机理解释。　　 综上,本研究在消除外因——对抗血清的抑制作用、消除内因——降低内在结构的细胞毒性两大技术难点上取得了较重大突破。本研究目标直指临床应用,完成了生物活性聚阳离子的分子设计、制备处方工艺筛选设计、结构表征；考察了聚阳离子的物理化学性能及生物学性能、细胞毒性和基因转染效能；考察了有无血清存在下的体外转染效率,以评价其走向临床应用的潜力。　　 1可供临床应用的聚阳离子型基因载体的理论构建和分子设计　　 期望得到的聚阳离子为:分子水平为纳米尺寸的球状或树枝状或星射状聚阳离子；为了降低其细胞毒性、提高其生物相容性、高速增加其端基活性官能团数目和整体分子量,采用星射状树枝末端修饰聚蛋白质多肽链为树枝链骨架；星射形树枝状长链内部、长链的链与链之间组成的内部骨架内富集大量蜂窝状巢穴；纳米分子球形外表面和蜂窝状巢穴内表面都挂满具有DNA结合和压缩能力的无毒的聚阳离子。当进入体内环境时,聚阳离子终端外表面结合的DNA预期被血管中和体液中的带负电的血清蛋白等类物质离析,经历与绝大多数其他聚阳离子相同的命运;而聚阳离子蜂窝状巢穴内表面结合的DNA将受到树枝链空间位阻的阻隔与蛋白质多肽链生物相容性的保护以及外表面可能全面被阴离子静电中和而不再带电的屏蔽而受到完全的保护,最后,这一部分DNA将顺利完成从给药到细胞内吞之前的细胞外转运以及从内涵体到溶酶体再到细胞核的细胞内吞后的细胞内转运,成功进入细胞核进行转录和表达。基于以上预期,我们将目光投向目前研究成果中能实现这一结构设想的聚阳离子——聚酰胺-胺树枝状高分子。　　 本研究利用终端基团为伯胺基的低代数无毒阳离子树枝状聚合物G2为中心引发核、引发聚谷氨酸聚合为星射状支链骨架,再将多个终端基团为伯胺基的无毒的低代数的小的星射状聚合物G1链接成可降解的无论是在分子外部还是分子内部都富含伯胺基的纳米级星射形树枝状阳离子大分子PAMAM衍生物,制得聚酰胺-胺-聚谷氨酸-聚酰胺-胺树枝状大分子三嵌段聚合物G2PAMAM-PGlu-G1PAMAM(ALA)。　　 2 ALA的合成与表征　　 五步法制备ALA。第一步,G1PAMAM和G2PAMAM的合成；第二步,L-谷氨酸-γ-苄酯的合成；第三步,聚谷氨酸苄酯羧酸酐的合成；第四步,两嵌段星射形树枝状大分子共聚物聚谷氨酸苄酯(G2PAMAM-PBLG)的合成；第五步,三嵌段星射形树枝状大分子聚合物G2PAMAM-PGlu-G1PAMAM(ALA)的合成,并以IR、1H NMR、MALDI-TOF等表征其有效合成。　　 3 ALA的毒性研究　　 以G1、G2或G5作为对照,MTT法定量测定ALA在三种不同细胞株:Hela、Bel7402和NIH3T3中的细胞毒性。结果表明:对于Hela细胞,ALA的细胞毒性与小分子G1接近,在含血清时16mg/mL或不含血清时900μg/mL的聚合物溶液条件下培育4 h,细胞存活率在90％以上,显著低于G5的细胞毒性。在无血清条件下,对于Bel7402和NIH3T3细胞中培育4 h,ALA1100μg/mL在Bel7402中和2500μg/mL在NIH3T3中,细胞存活率均在95％以上,显著低于G5的细胞毒性。在有血清状态下,ALA/DNA在Hek293细胞中,可长时间与细胞接触,不显示明显的细胞毒性。　　 4 ALA/DNA复合物作为基因转染载体的性能研究　　 G1、G2以及G5为对照,琼脂糖凝胶电泳法测定ALA结合DNA的能力,结果显示ALA较大程度地改善了G1、G2结合DNA的能力；DLS法测定聚合物ALA/DNA复合物粒径和ζ-电位,结果表明,ALA具备结合并压缩DNA形成适宜尺寸(～150 nm)并携带适宜ζ-电位(10～15mV)纳米粒的能力,ALA具备作为基因载体的相关性能。　　 5 ALA/DNA复合物作为基因转染载体的功能研究　　 以G5和阳离子脂质体Lipofectamine2000(Lipo)为阳性对照,以Hek293,Bel7402和Hela细胞为靶细胞,以流式细胞仪定量测定,以荧光显微观察和拍照定性观察,绿色荧光蛋白pEGFP-C1为报告基因,分有无血清、不同细胞株、不同转染荷载时程三种状况,考察体外转染效率。结果显示,对于Hek293细胞,无血清荷载转染状态下,ALA转染效率远低于G5及Lipo,接近G5及Lipo的一半值;但在有血清荷载转染状态下,ALA在N/P10、20和30时转染效率随N/P增加而增加,差异显著,远高于G5及Lipo,分别是G5的8倍和Lipo的3.5倍。ALA在N/P30时达到最大转染效率接近58％。有血清时,ALA对不同细胞的转染效率均高于G5和Lipo,ALA/DNA复合物对不同细胞的转染效率排序是:Hek293>Bel7402>Hela。有血清ALA/DNA荷载转染Hek293细胞,转染质粒用量1μg,转染最长荷载时间为38 h,转染效率呈逐小时缓慢而持久增长的时间依赖性,呈现出良好的38h以上的缓释趋势,几乎无细胞毒性。以38h的转染效率为100％的话,实现15％转染率需4h转染荷载时间,40％需7h,60％需9h,70％需12h,90％需18h。半数转染率(50％)的实现时间约为8h。　　 6 ALA/DNA复合物在模拟体内状态的有血清状态下的38h基因转染动力学数学模型拟合　　 ALA介导绿色荧光蛋白Pegfp-C1体外转染Hek293细胞,在38h有血清荷载转染状态下,呈现缓慢的基因转染趋势。最优拟合的基因转染时间动力学方程:　　 Mt=-9.76673+8.434t-0.1661t2　　 7 ALA/DNA复合物基因转染缓释并对抗血清抑制的三维分子结构机理模型的构建　　 ALA/DNA复合物粒子因源于ALA内在设计结构导致的静电屏蔽、空间位阻、伯胺基过剩、类球蛋白外形、低毒性和缓释特性,使其在血液中的稳定性得以提高,其在血液循环中的半衰期得以延长,其生物相容性得以提高,能对抗血清抑制,其转染效率在有血清条件下得以提高,有进入临床基因载体应用的潜力。　　 由本研究创新的功能高分子设计思路所制得的星射形树枝状三嵌段聚酰胺-胺-聚谷氨酸-聚酰胺-胺(ALA)聚合物毒性低、能对抗血清抑制、转染效率高,有进入临床基因载体应用的潜力。　　 总结本研究在六个方面实现了创新:ALA实现了抗血清抑制功能、实现了持久缓慢而逐渐提高的带显著缓释特征的转染效率、表现了显著低的毒性、实现了高速度获得高代数PAMAM的创新合成路径以及创新地提出了基因转染时效动力学拟合函数方程。