论文部分内容阅读
目的:探讨天然药物单体莪术醇联合紫杉醇对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡的影响及其相关分子机制。方法:1.CCK-8实验分别测定不同浓度梯度的莪术醇(CC)和紫杉醇(PTX)在不同时间点对MDA-MB-231细胞活力的抑制率,从而初步判定其对细胞增殖的影响。2.根据以上CCK-8的实验数据计算出莪术醇和紫杉醇对MDA-MB-231细胞作用48h对应的半抑制率(IC50),然后依据此IC50设计不同浓度梯度的莪术醇单药,紫杉醇单药,莪术醇联合紫杉醇进一步对MDA-MB-231细胞作用48h,CCK-8实验再次检测各组细胞的活力情况。根据实验检测数据,应用Compu Syn软件计算药物联合指数(CI),判断莪术醇联合紫杉醇在抗MDA-MB-231细胞增殖方面是协同,叠加还是拮抗作用。根据联合药物FA-CI曲线,将后续实验分为对照(Control)组,莪术醇(CC,250μM)组,紫杉醇(PTX,2.5μM)组,联合(CC+PTX,250μM+2.5μM)组。3.细胞克隆形成实验检测药物作用48小时后各组细胞的增殖能力。4.Hochest33258免疫荧光凋亡染色试剂盒和流式细胞仪观察、分析药物作用48小时后各组细胞的形态学改变和凋亡率。5.免疫印迹法检测药物作用48小时后各组细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),B细胞淋巴瘤/白血病-2相关因子X(Bax),增殖细胞核抗原(PCNA),含锌指和BTB结构域蛋白7A(ZBTB7A)、核转录因子κB p65(NF-κB p65)蛋白的表达情况。6.建立乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤模型,4天后根据体重随机数字表法分为对照(Control)组,莪术醇(CC,100 mg/kg)组,紫杉醇(PTX,10 mg/kg)组和联合(CC+PTX,100 mg/kg+10 mg/kg)组,每组7只裸鼠,每两天腹腔给药一次,每四天测量一次裸鼠体质量、瘤体长短径。连续给药7次后,处死裸鼠并对裸鼠移植瘤进行解剖和称重,同时结合数据记录对各组肿瘤生长情况和裸鼠体质量变化情况进行分析。免疫组化检测PCNA,ZBTB7A和NF-κB p65,判断组织定位和分析各组间阳性率差异,同时应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Tunel)和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)凋亡双染法对各组肿瘤组织进行染色并分析凋亡率差异。结果:1.不同浓度梯度的CC、PTX对MDA-MB-231细胞的增殖具有抑制作用,且呈时间-浓度依赖性。2.CC和PTX对MDA-MB-231细胞48h的IC50分别为558.6μM和4.4μM。根据Compu Syn软件计算得出CC联合PTX存在协同效应(CI<1),且取两者联合药物作用48h对MDA-MB-231细胞CI=0.509,FA=0.593时CC和PTX的浓度作为后续实验的分组依据。3.克隆形成实验显示:与Control组相比,CC组、PTX组、CC+PTX组细胞的增殖能力下降,CC+PTX组增殖能力最低(P<0.05)。4.Hochest33258免疫荧光凋亡染色和流式细胞仪显示:Control组细胞核蓝色均染,CC组,PTX组,CC+PTX组细胞核染色不均,部分核固缩、碎裂、溶解,CC+PTX组最为显著。与Control组相比,CC组,PTX组,CC+PTX组细胞的凋亡率增加,CC+PTX组细胞凋亡率最高(P<0.05)。5.免疫印迹显示,与Control组相比,CC组,PTX组,CC+PTX组Bcl-2、PCNA、ZBTB7A和NF-κB p65蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高,CC+PTX组最为显著(P<0.05)。6.裸鼠移植瘤体外实验显示,与Control组相比,CC组,PTX组,CC+PTX组移植瘤体积和瘤体质量降低,CC+PTX组移植瘤体积和瘤体质量最低。四组裸鼠在实验前后体重变化无明显差异。PCNA、ZBTB7A、NF-κB p65阳性定位于细胞核,呈棕黄色颗粒沉着。与Control组相比,CC组,PTX组,CC+PTX组PCNA、ZBTB7A、NF-κB p65阳性表达率降低,CC+PTX组阳性表达率最低(P<0.05)。Tunel和DAPI双染法显示,与Control组相比,CC组,PTX组,CC+PTX组组织细胞凋亡率升高,CC+PTX组凋亡率最高(P<0.05)。结论:1.莪术醇、紫杉醇对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231能起到显著抑制增殖,促进凋亡的作用,且以上作用在两者联合应用表现出协同效应。2.莪术醇联合紫杉醇影响三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡的可能机制是通过NF-κB信号通路下调ZBTB7A的表达。