谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是重要的工业微生物,目前已被广泛的应用于多种产品的生物制造。但是,谷氨酸棒杆菌基因组中仍有超过40%的基因功能未知或缺乏实验证据,限制了谷氨酸棒杆菌细胞工厂的人工设计与改造。通过基因组规模基因扰动文库的构建与筛选可在全基因组范围内发掘具有特定生物学功能的元件,系统的研究基因型与表型的对应关系。但是,目前谷氨酸棒杆菌尚未有全面且高效的全基因组规模文库构建方法。近年来,碱基编辑技术凭借精简、高效、快速的特点,以及不产生双链DNA断裂、不需要外源模板且不依赖同源重组的优势,已在多种微生物中得到开发与应用,同时多重基因组编辑技术也在不断发展,为全基因规模文库的构建与筛选提供了新的研究思路。因此,本研究首先对谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统进行了优化,建立了基于t RNA加工的多重g RNA表达框,丰富了谷氨酸棒杆菌的基因组编辑工具;同时利用谷氨酸棒杆菌中已开发的碱基编辑技术,对全基因组可用于失活基因的sg RNA进行计算、选择并合成,构建了全基因组规模单基因失活文库,并利用该文库进行了功能基因的筛选与验证。具体研究内容与结果如下:（1）谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9多位点碱基编辑系统的优化开发基于细胞内源的t RNA加工的多重g RNA表达框,该形式只需要一个启动子和一个终止子序列,极大的简化了表达框结构,能实现两基因和三基因的同时编辑。其中,两基因同时编辑效率为（91.67±4.15）%,三基因同时编辑效率为（33.33±7.22）%。（2）谷氨酸棒杆菌全基因组规模单基因失活文库的构建与筛选首先选择sp Cas9与sp Cas9-VQR碱基编辑器,计算、选择并合成了靶标谷氨酸棒杆菌全基因组的11647条sg RNA,全基因组基因覆盖率高达98%（3041/3099）。之后,依次构建了sg RNA质粒文库、全基因组单基因失活文库,并对建库过程中sg RNA及基因覆盖率、Cas9-AID蛋白表达质粒去除效率以及文库基因编辑比例进行了评估。最后利用全基因组单基因失活文库,分别在添加5-FU或5-FOA的培养条件下对文库进行筛选,对富集到的基因进行单独失活验证,成功获得与筛选表型相关的功能基因,加深了对谷氨酸棒杆菌基因功能的了解。