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油菜菌核病是世界范围的病害，同时它也是中国油菜三大病害之一，严重影响了我国的油菜生产，因此，油菜抗病育种工作日益受到研究者的重视。本试验在芸芥抗菌核病分子基础方面作了一些初步研究，旨在从分子生物学领域为油菜抗病育种提供科学依据。其结果如下： 1．本试验以芸芥为材料，分别用CTAB法、SDS法、尿素法、NaOH法四种方法对芸芥基因组DNA进行了提取；并用紫外光分光光度计法、琼脂糖电泳法和RAPD分析法对所提取的DNA进行检测，并对四种方法在DNA的产量、质量和耗时、耗费等方面的优缺点进行了总结，以便在实际工作中根据不同的试验条件选取最佳提取方法。通过四种方法比较后认为，尿素法是芸芥基因组DNA的最佳提取方法。 2．通过芸芥总基因组DNA为模板，对RAPD反应程序中的重要参数进行摸索和优化试验，建立了随机扩增多态性DNA分析应用反应体系，即反应体积25ul，模板DNA30～40ng，Mg2+2.0mmol/l，dNTP0.1mmol/l，随机引物0.2ummol/l，Taq聚合酶1U；反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性40s，37℃退火1min，72℃延伸2min，循环41次。该体系可有效地应用在芸芥遗传育种研究中，重复性好，可靠性高。 3．利用3种常规菌核病鉴定方法对11个芸芥品种及对照的抗病性进行鉴定；进一步根据拟南芥等植物抗病基因序列，人工合成了8条引物，并从中筛选出了一对引物对11个经过常规鉴定的芸芥品种进行抗性验证。结果表明：草酸浸叶法、草酸浸根法、苗期菌丝琼脂块接种法3种鉴定结果差异不显著；相关分析表明，三种常规鉴定法的病情指数相关系数均达极显著水平，分别为0.929、0.950、0.966；在PCR扩增中，经常规鉴定表现抗病的品种出现了一条290bp大小的特异片断，而感病品种则没有出现，这证明了分子检测的可行性。 4．利用RAPD技术，用100个10碱基随机引物对18个芸芥品种的总基因组DNA进行扩增，其中10个引物扩增得到了稳定一致的RAPD图谱，扩增条带数湖南农业大学博士论文 芙芥抗油菜菌核病分于基础的研究 钟 军，在 6～门条之间；通过对扩增的 108个多态性位点，采用聚类法中的 UPGMA法，对18个芙芥品种进行聚类分析，以揭示它们的亲缘关系，最后将供试的会芥品种分成二类八组；并运用特殊谱带建立芙芥品种的分子识别表。 5．植物对病害的抗性主要是由R基因决定的。目前已经克隆了20多个R基因，大部分都属于NBS工M类，这类基因编码的NBS和LRR都有保守的结构域。鉴于此，本试验根据其中的P－loop和XinaseZa保守区设计了一对引物，通过PCR反应，在苔芥植物中扩增了NBS同源序列，测序结果表明，它与与拟南芥RPPS基因只有43％的氨基酸相同，50％的氨基酸类似，可能代表着不同的NBS抗病序列。 6．本试验以抗菌核病的会芥品种柴门与感菌核病的甘蓝型油菜品种98C40进行远缘杂交，对杂交后代 117株 FZ分离个体进行抗菌核病鉴定和抗病性遗传学分析，通过遗传分析和卡方检验证实杂交后代符合3：l的分离规律。依据混合群体分组分析法①SA)建立抗菌核病基因池和感菌核病基因池，通过RAPD试验，从220个引物中筛选出了一个在两池间具有多态性的引物SI 466，用双亲、FI、FZ单株DNA进行RAPD试验证明了该引物扩增出的特异性片段S 1466－500是一个与抗菌核病基因连锁的RAPD标记，用JOpoMAP（versionl．4）软件计算抗病基因与标记间的重组值为6．473O，连锁距离为7．156CM。