海马是一种名贵的中药材。已有研究表明海马富含活性物质,具有抗氧化、抗炎症、抗疲劳和激素样作用。本实验以LPS刺激的BV-2小鼠小胶质细胞和RAW264.7小鼠巨噬细胞为体外抗炎细胞模型,研究一种来源于海马(Hippocampus kuda)的化合物2’-羟基-5’-甲氧基苯乙酮(2H5M)的抗炎作用及其抗炎机制。本论文的主要内容包括:(1)利用MTT实验和Countstar自动细胞计数仪研究在不同浓度的化合物2H5M对BV-2和RAW264.7细胞的细胞毒性作用和细胞直径的影响。实验结果表明,当化合物浓度为10,20,50,100和200μM时,不影响两种细胞的存活率和直径大小;(2)利用Griess试剂法测定化合物2H5M对LPS诱导的BV-2和RAW264.7细胞中NO含量的抑制作用。实验结果表明,化合物2H5M可有效抑制NO的释放量,并呈浓度依赖型;(3)利用Elisa试剂盒测定化合物2H5M对LPS诱导的BV-2和RAW264.7细胞中TNF-α分泌量的抑制作用。实验结果表明,化合物2H5M可有效抑制TNF-α的分泌量,并呈浓度依赖型;(4)利用荧光显微镜和荧光探针DCFH-DA检测化合物2H5M对ROS的清除作用。结果表明,化合物2H5M可有效清除ROS;(5)利用Western blot分析检测化合物2H5M对促炎蛋白iNOS和COX-2的抑制作用。结果表明,化合物2H5M可抑制这两种蛋白的表达;(6)利用Western Blot分析了化合物2H5M对MAPK信号通路的影响。结果表明,化合物2H5M可抑制ERK的磷酸化水平,但对p38和JNK信号通路无影响;(7)利用Western Blot分析了化合物2H5M对NF-κB信号通路的影响。结果表明,化合物2H5M可抑制NF-κB p65和IκB蛋白的磷酸化水平;(8)利用细胞免疫荧光实验检测化合物2H5M对NF-κB p65蛋白核易位的抑制作用。实验结果表明,化合物2H5M能够抑制p65蛋白的核易位;(9)利用EMSA实验分析化合物2H5M对NF-κB DNA结合能力的影响。结果表明,化合物2H5M可抑制NF-κB与DNA的结合;(10)利用Discovery Stadio3.5进行分子对接,模拟和阐明化合物2H5M与NF-κB的相互作用。对接结果表明化合物2H5M可以与NF-κB蛋白中Lys,Trp,Met,His等氨基酸残基,形成范德华力、氢键及p键。综上所述,化合物2H5M可有效清除LPS刺激BV-2和RAW264.7细胞中NO、TNF-α和ROS的含量,并抑制促炎蛋白iNOS和COX-2的表达水平,初步判断化合物具有抗炎的作用。进一步对其抗炎相关信号通路进行探究。研究结果表明,化合物2H5M对MAPK和NF-κB信号通路中关键蛋白的磷酸化具有抑制作用,并抑制NF-κB的核易位作用及其与特定DNA序列的结合力。此外,分子对接实验验证化合物2H5M可与NF-κB具有相互作用。因此,本实验推测化合物是通过抑制NF-κB信号途径的激活从而来发挥抗炎作用。