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稳定的抗原和安全、有效的佐剂是疫苗研究的重点和难点。针对灭活口蹄疫病毒(inactivated foot and mouth disease virus,iFMDV)抗原稳定性差、极易发生裂解导致免疫活性降低,目前常用商业化的ISA 206乳液佐剂难以有效激发细胞免疫,且会进一步降低iFMDV稳定性的问题,本课题在深入研究iFMDV抗原体外稳定性对体内免疫活性的影响规律基础上,提出以具有良好生物相容性的正电荷固体脂质纳米颗粒(cationic solid lipid nanoparticles,cSLN)和表面修饰Zn2+的壳聚糖纳米颗粒(CP-PEI-Zn)为佐剂,设计可以在保护抗原结构稳定的同时,有效提升抗原免疫应答效率的新佐剂和新的抗原运载方式。主要研究内容与结果如下:(1)研究了 iFMDV体外稳定性对体内免疫活性的影响及其规律。分别通过疏水层析、聚乙二醇沉淀、疏水层析结合分子排阻层析、以及疏水层析结合聚乙二醇沉淀等四种工艺纯化制备iFMDV,发现第四种工艺所制备的抗原具有最好的稳定性,免疫小鼠的抗体水平也最高。进一步改变第四种纯化工艺制备抗原的溶液环境以准确调控iFMDV的稳定性,在抗原纯度和免疫剂量相同条件下开展细胞和动物实验,进一步证实了抗原越稳定,越能有效激活骨髓源树突状细胞(BMDC),促进iFMDV特异性IgG和IgM抗体的分泌。(2)以山嵛酸甘油酯为脂质材料,以双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)为阳离子脂质体,通过O/W乳化法,制备出粒径250 nm左右,分散性良好、带有正电荷的cSLN,用于静电吸附146S(即颗粒完整的iFMDV)。发现低离子强度有利于cSLN对146S的吸附,却会导致146S的快速裂解。在10 mM PB,0.075 MNaCl(pH 8.0)的最适负载条件下,cSLN对146S的吸附效率为87.8%,负载量为70.2 μg/mg。透射电镜可以观测到cSLN表面完整的146S颗粒,且负载于cSLN上的146S裂解温度Tm提高了 1.2℃;高效液相层析尺寸排阻色谱(HPSEC)分析从cSLN表面洗脱下来的146S,证实146S颗粒结构的完整性。上述结果显示cSLN作为iFMDV佐剂有利于保持抗原结构的稳定。(3)通过细胞和动物实验评价了 cSLN作为iFMDV佐剂的效果。cSLN的运载使BMDC对146S的摄取比例提高了 6倍以上,BMDC表面共刺激因子及MHCI表达水平显著提高。小鼠实验结果显示,cSLN显著促进FMDV的体液免疫和细胞免疫,特异性抗体(IgG,IgG2a和IgG1)的分泌水平以及记忆T细胞的增殖活化,均优于目前广泛应用的ISA 206油乳佐剂。(4)基于iFMDV表面存在大量组氨酸可以与过渡金属离子配位结合的机理,制备表面修饰Zn2+的交联壳聚糖纳米颗粒(CP-PEI-Zn),提出通过iFMDV-Zn2+配位结合运载抗原的新模式。HPSEC分析证实了 CP-PEI-Zn负载146S主要通过与Zn2+的配位作用,而PEI修饰的壳聚糖(CP-PEI)则通过静电作用负载146S。146S@CP-PEI-Zn的Tm略高于146S@CP-PEI,表明配位结合更有利于146S的稳定。动物实验结果表明,CP-PEI-Zn和CP-PEI用于iFMDV佐剂,在诱导特异性抗体反应、B淋巴细胞活化、T细胞增殖和效应记忆T细胞分化方面均优于ISA 206乳液佐剂。相比于CP-PEI,CP-PEI-Zn对效应记忆T细胞的增殖和细胞因子的分泌有更强的促进作用,表明壳聚糖颗粒与146S配位结合方式诱导了更强烈的细胞免疫应答。综上所述,本研究所制备的正电荷固体脂质纳米颗粒和壳聚糖微球稳定了抗原结构并增强了抗原的体液免疫和细胞免疫水平,并且生物安全性好,制备简单,成本低廉,有广阔的应用前景。