研究背景及意义结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是指由于基因、饮食和环境等多种致病因素的综合作用下,结直肠粘膜的上皮组织转化而成的恶性肿瘤,其发病率及死亡率分别位于全球恶性肿瘤的第三和第四位。在发达国家,其发病率更是位居恶性肿瘤的第二位。当结直肠癌病变局限于肠壁时,通过外科手术切除病灶,约70%-80%的病人能够治愈,其5年生存率约为90%;但淋巴结转移的患者5年生存率则锐减到60%。目前由于结直肠癌的早期诊断依旧困难,相当一部分患者就诊时就已经有转移了,所以结直肠癌的早期诊断及治疗具有非常重要的临床意义。肿瘤的形成和进展是一个相当复杂的过程,涉及多个作用因素,基因突变和异常表达对肿瘤的形成和进展发挥重要调节功能。由于对结直肠癌形成有关癌基因、抑癌基因及作用机制等研究的进展,人们越来越意识到非编码RNA、DNA的甲基化作用、组蛋白修饰以及染色质位置和结构变化对结直肠癌的形成及进展发挥非常重要的作用。长链非编码RNA(longnon-codingRNAs,lncRNAs)是长度为200-100.000碱基对的非编码RNA分子,在早期研究中,lncRNAs—直被科学家认为是一些没有意义的转录片段而被忽视。但是随着高通量基因测序技术的出现,lncRNAs的研究逐渐深入,通过对一些具有特异性表达水平的IncRNAs进行具体研究和分析,发现lncRNAs在基因的调节方面发挥重要作用。目前关于lncRNAs的来源已达成5种共识:第一、具有蛋白质编码功能的mRNA由于基因突变,从而失去其正常编码的功能,形成了具有调控基因功能的lncRNAs;第二、由于染色体重排,导致一些距离较远的基因片段互相靠近结合,构成新的IncRNAs;第三、在逆转录转座过程中,其形成重叠的片段;第四、由基因片段在复制的过程中重复而生成;第五、由于基因的插入,从而形成了新的lncRNAs。目前研究发现lncRNAs可以通过作用于其临近的基因发挥调控作用(正义调控),也能够作用于其相邻较远的基因,从而发挥基因调控作用(反义调控)。LncRNAs来源的研究对于探索其功能具有重要意义。LncRNAs与肿瘤的发生发展具有重要关系,目前研究逐渐认识到lncRNAs可能成为肿瘤诊断和治疗的重要标志物和靶点。在诊断方面,由于肿瘤组织中的lncRNAs表达往往异常,且具有组织和种属特异性,使其可能成为肿瘤标志物,尤其是在一些肿瘤的早期,由于其体积小,传统的影像学方法不易发现。通过检测血液中的lncRNAs,能够便捷的了解病人罹患某种肿瘤的可能性。在治疗方面,lncRNAs在肿瘤中发病机制中的研究为新的肿瘤治疗靶点的选择及研发新的高效、精准、低毒副作用的抗癌新药提供了思路。目前lncRNAs的研究还处于初级阶段,对lncRNAs作用机制和功能的研究还在探索之中。这些年随着lncRNAs成为肿瘤研究中的热门分子,在人类的各种肿瘤中,不断有新的异常表达的lncRNAs被发现。例如研究发现乳腺癌患者肿瘤组织和血浆中HOTAIR的表达增高,且血浆中lncRNAHOTAIR水平与雌激素受体(ER)水平和淋巴结转移显著相关,进一步研究显示血浆中HOTAIR水平可以作为乳腺癌诊断的潜在生物标志物。另有研究显示lncRNACCAT2在前列腺癌中高表达且与前列腺癌的预后差相关,进一步研究显示长链非编码lncRNACCAT2能影响前列腺癌的上皮-间充质转化从而促进肿瘤转移。此外,非小细胞肺癌中lncRNAGAS5-AS1的表达明显低于癌旁正常肺组织。低表达GAS5-AS1与较大的肿瘤体积、较晚的TNM分期及淋巴结转移显著相关。而异常表达GAS5-AS1对细胞周期、凋亡及增殖没有影响,但是能够显著影响非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭。在非小细胞肺癌细胞中过表达GAS5-AS1能够减少ZEB1、N-钙粘蛋白、波形蛋白及SNAIL1表达,从而影响其上皮-间充质转化。近些年有关lncRNAs在结直肠癌中作用的报道越来越多。例如研究显示lncRNAAFAP1-AS1在结直肠癌组织和HCT116和SW480细胞株中表达显著上升。降低lncRNAAFAP1-AS1表达能够抑制SW480细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭。此外降低AFAP1-AS1能够抑制肿瘤上皮-间充质相关基因的表达。另有研究显示lncRNASNHG20在结直肠癌组织中表达显著上调,SNHG20高表达与患者TNM分期密切相关。多变量分析提示高表达SNHG20是结直肠癌患者总体生存期差的独立预后因素。进一步的功能实验表明,降低SNHG20表达能够抑制细胞的增殖、侵袭和迁移,并影响结直肠癌细胞的细胞周期进程。此外,SNHG20调控细胞生长是通过调节一系列的细胞周期相关基因实现的。此外,研究显示lncRNA ucoo2kmd.1通过竞争miR-211-3p调控CD44依赖性的大肠癌细胞的生长。而作为lncRNAs家族重要成员之一的GAPLINC,在结直肠癌中的功能目前仍然不清楚。GAPLINC是一个长度为924bp的长链非编码RNA,GAPLINC在胃癌组织中的表达高于对照组,相关性分析表明GAPLINC高表达与肿瘤大小及淋巴结转移呈正相关。生存分析结果显示GAPLINC高表达的胃癌患者其生存率较低表达患者低。研究显示GAPLINC能够通过调控CD44表达进而增强胃癌细胞的增殖与侵袭能力。进一步研究显示GAPLINC调控CD44是通过作为miR-211-3P的ceRNA,从而调控CD44的表达。而GAPLINC在其它肿瘤中的研究较少。目前关于 lncRNA GAPLINC在结直肠癌中的研究仍然较少。因此,研究GAPLINC在结直肠癌中的表达、功能及作用机制有非常重要的临床意义。我们通过下面3部分的实验对GAPLINC在结直肠癌中的功能进行了研究:第一、应用实时荧光定量PCR研究lncRNA GAPLINC在结直肠癌、癌旁组织及结直肠癌细胞系的表达情况;对结直肠癌患者临床资料进行分析,评价其表达与各临床病理特征的相关性,并预测其对结直肠癌患者预后的影响。第二、应用qRT-PCR实验选择高表达lncRNA GAPLINC的结直肠癌细胞系;设计针对GAPLINC特异性沉默的RNA小分子片段,分别转染选定的结直肠癌细胞系,从中选择干扰效率最高的RNA小分子片段进行后续实验。第三、体外实验研究干扰lncRNA GAPLINC表达对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期及凋亡等表型的影响;应用蛋白免疫印迹及细胞免疫荧光验证GAPLINC激活Wnt/β-catenin信号通路影响结直肠癌细胞的生物学行为,进而明确lncRNA GAPLINC促进结直肠癌生长及进展的信号机制。第一部分LncRNA GAPLINC在结直肠癌中的表达及临床意义实验目的:检测结直肠癌标本及结直肠癌细胞系中1ncRNA GAPLINC的表达,研究其表达与结直肠癌患者临床病理特征及其预后的关系。实验方法:收集2007-2008年山东大学附属齐鲁医院行根治性手术的64例结直肠癌病人的癌组织标本及匹配的癌旁正常组织,应用qRT-PCR检测lncRNA GAPLINC的表达水平并对患者临床资料进行统计;qRT-PCR检测lncRNA GAPLINC在结直肠癌细胞株及正常人肠上皮细胞系中的表达水平。运用卡方检验和Fisher精确概率法分析lncRNA GAPLINC表达与结直肠癌患者临床病理特征的相关性,应用Kaβlan-Meier法绘制病人的生存曲线,1og-rank检验比较两组间生存率差异,运用多因素Cox比例回归模型预测各个临床指标的预后意义。实验结果:qRT-PCR结果表明结直肠癌病人肿瘤标本及结直肠癌细胞系中的IncRNA GAPLINC表达较对应癌旁正常组织及人肠上皮细胞系FHC细胞明显增高(P<0.05)。相关性分析结果表明lncRNA GAPLINC与结直肠癌的局部浸润深度、淋巴结转移及肿瘤TNM分期显著性相关(P<0.05),而与病人年龄、性别、肿瘤大小及组织分化程度无显著相关性(P>0.05)。生存分析显示lncRNA GAPLINC高表达的患者整体存活期明显低于lncRNA GAPLINC低表达患者(P<0.05)。多因素分析表明,GAPLINC是影响结直肠癌患者生存的独立危险因素。结论:LncRNA GAPLINC在结直肠癌中高表达且与肿瘤的进展及预后密切相关,GAPLINC可能成为结直肠癌新的预后标志物和治疗靶点。第二部分SiRNA靶向沉默结直肠癌细胞系lncRNA GAPLINC表达实验目的:筛选lncRNA GAPLINC表达水平较高的结直肠癌细胞系,设计并选择出GAPLINC干扰效率最高的siRNA。实验方法:选择3个结直肠癌细胞系,并分别进行了 qRT-RCR实验检测3个细胞系中lncRNAGAPLINC的表达水平。设计能特异性抑制lncRNA GAPLINC表达的siRNA片段,检测其干扰效率。实验结果:3个结直肠癌细胞系中,HCT116和HT29具有相对较高的GAPLINC表达水平(P<0.05)。序列为 5’-GCCAUCUCCAUAACAUAAATT-3’的 siRNA具有最明显的基因沉默效应(P<0.05)。结论:成功筛选出lncRNA GAPLINC表达水平较高的结直肠癌细胞系,合成高效十扰片段,为后续实验做准备。第三部分干扰lncRNA GAPLINC表达对结直肠癌细胞表型的影响及机制探讨实验目的:体外实验研究lncRNA GAPLINC对结直肠癌细胞系增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡等细胞表型的影响及可能机制。实验方法:将si-GAPLINC转染GAPLINC高表达的结直肠癌细胞系,应用CCK8实验检测结直肠癌细胞增殖,划痕实验分析细胞体外迁移能力,Matrigel侵袭实验检测结直肠癌细胞体外侵袭能力,流式细胞术对细胞凋亡及细胞周期进行分析。Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路下游蛋白的表达水平,运用细胞免疫荧光检测β-catenin入核情况。实验结果:CCK8实验表明低表达lncRNA GAPLINC能够显著抑制结直肠癌细胞HCT116和HT29的增殖能力(P<0.05);划痕实验表明降低lncRNA GAPLINC表达后结直肠癌HCT116和HT29细胞系的迁移能力明显下降(P<0.05);Matrigel侵袭实验表明干扰lncRNA GAPLINC表达后结直肠癌HCT116和HT29细胞的侵袭能力显著下降(P<0.05);流式细胞术分析结果表明HCT116和HT29细胞株沉默lncRNA GAPLINC表达后GO/G1期所占细胞数目显著增高,与此同时S期的细胞数目显著降低(P<0.05);细胞凋亡显示相对于对照组,lncRNA GAPLINC表达下调能够促进结直肠癌细胞系HCT116和HT29的凋亡(P<0.05)。Western blot及细胞免疫荧光结果显示lncRNA GAPLINC能够激活Wnt/β-catenin 信号通路。结论:体外实验表明,lncRNA GAPLINC能够增强结直肠癌细胞系的增殖、迁移及侵袭能力,并能显著抑制细胞凋亡;lncRNA GAPLINC可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进结直肠癌的发生发展。