论文部分内容阅读
研究背景由于介入技术的广泛应用,使安全、快速恢复血流成为可能,这极大推动了临床对急性脏器缺血的治疗。虽然快速恢复缺血器官血流灌注是重要的,但它却可导致“缺血再灌注损伤”(Ischemia Reperfusion Injury,IR injury),从而加剧局部损伤并能引起金身并发症,使病人临床预后较差。“控制性再灌注”(ControlledReperfusion,CR)通过对初始灌注期进行干预,已成功应用于器官移植及心脏外科领域,被认为有巨大潜力来提高临床疗效。但是“控制性再灌注”的概念在临床应用中仍然强调不足。重要原因之一是目前缺乏理想的体内实验模型来进行系统深入的前临床基础研究。本研究旨在以大鼠急性缺血后肢为实验平台,建立一种新的基于临床应用的控制性再灌注体内模型,并以此对控制性再灌注后机体局部和系统功能恢复进行评估,同时从蛋白分子水平对相关病理信号通路进行研究,并进一步探讨其相关机制,为控制性再灌注广泛应用于临床提供基础研究支持。材料与方法Ⅰ大鼠缺血后肢控制性再灌注模型的建立首先诱导大鼠急性后肢缺血。与传统模型不同之处,本实验将止血带置于股鞘之下,后结扎股动脉,开放股静脉,防止由于股静脉机械受压而致静脉瘀血。成功诱导后肢缺血后,通过同侧腹壁下动脉插管,微泵辅助下实行控制性再灌注。Ⅱ控制性再灌注对大鼠重度后肢缺血后局部及系统功能的影响大鼠随机分为传统手术组(n=7;缺血4小时后直接恢复血流灌注)和控制性再灌注组(n=7;缺血4小时后在恢复血流灌注前以冷却无氧肝素化林格氏液进行预灌注)。两组大鼠在再灌注4小时后处死,取材做进一步实验。每只大鼠采用非缺血后肢作为内对照。分别检测胫前肌含水量、骨骼肌形态结构(光镜)、肌收缩力变化。Ⅲ控制性再灌注对缺血下肢保护作用的机制大鼠随机分为假手术组(n=5)、传统缺血再灌注组(n=10)、控制性再灌注组(n=10),Fetpps干预组(n=10);除假手术组外,其他各组又随机分为缺血后再灌注0h,4h两亚组,每亚组动物各5只。分别于再灌注后0h,4h小时处死大鼠,取材做进一步实验。分别检测骨骼肌中MDA含量、血浆CK水平,采用蛋白免疫印迹分析技术检测不同灌注条件下缺血后肢肌肉中的硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)水平时程变化及P13 K/Akt信号转导通路的活化情况。结果1.经大鼠腹壁下动脉插管对缺血后肢实行在体控制性再灌注切实可行,该模型建立技术稳定可靠。2.与同组内非缺血正常下肢相比,缺血/再灌注损伤对传统手术组和控制性再灌注组缺血后肢影响显著,总湿干重比值增加为159±44%(P<0.05),而肌肉的活力和收缩力分别减少到65±13%(P<0.05)和45±34%(P<0.05)。然而与传统手术组组间比较,控制性再灌注明显减轻前述效应,显著降低组织水肿程度(132±16%和185±42%(P<0.05),更好地保存了肌肉活力(74±11%和57±9%(P<0.05)和收缩力(68±40%和26±7%(P<0.05)。此外,各灌注时间点经激光多普勒扫描双后肢血流灌注,结果表明控制性再灌注组缺血后肢血流灌注恢复明显优于传统手术组(P<0.05)。3.各灌注时间点,控制性灌注组血浆CK、MDA、NT水平显著降低(P<0.05),Akt磷酸化水平显著升高(P<0.05)。结论1.首次建立稳定可靠,切实可行的大鼠后肢控制性再灌注体内模型。2.控制性再灌注明显减轻下肢缺血再灌注损伤,显著改善重度缺血后肢功能恢复。3.P13K/Akt信号通路激活介导控制性再灌注对严重缺血下肢的保护作用,其机制可能与减少自由基损伤和抗氧化作用加强有关。4.本研究进一步阐释控制性再灌注的概念,并为其系统性应用于临床提供基础研究支持。展望本研究结果提示控制性再灌注的巨大临床应用潜力,并为进一步推动其广泛应用于临床提供基础研究支持,为治疗急性缺血性下肢疾病,降低缺血再灌在损伤提供新的思路和对策。同时,通过本研究初步认识到:活化PI3K/Akt通路,清除ONOO~-,参与介导控制性再灌注对肢体缺血再灌注损伤的保护,这对将来通过调动机体内源性抗损伤机制来减轻细胞的缺血再灌注损伤,为今后的研究提供了新的、有前途的方向。