淡黄花百合响应热胁迫的分子机制和遗传转化研究

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百合(Lilium spp.)为六大切花之一,性喜凉爽湿润的环境,多能经受低温,但耐热性较差。目前我国主栽的百合品种生长发育的适宜温度为16-24℃,超过30℃便被抑制。而国内夏季常出现35℃以上的高温天气,这使得切花品质降低,种球退化,制约其周年生产。培育耐热的百合品种,是解决夏季百合生产问题的一大途径。我国有大量百合属种质,充分利用自有资源对培育适宜我国推广种植的耐热百合品种具有重要意义。本文围绕淡黄花百合(Lilium sulphureum Baker apud Hook.f)展开了耐热机理研究,且建立和优化了其遗传转化体系,为耐热基因的功能研究奠定基础。具体内容如下:(1)百合属植物耐热性鉴定。通过百合属植物田间物候观测统计与生理生化指标的测定,筛选鉴定到淡黄花百合具有优良的耐热性,适宜作为百合耐热育种资源。(2)淡黄花百合响应热胁迫的生理生化指标变化趋势。对淡黄花百合的3年生苗进行42℃热处理0 h、0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h,以研究热激对淡黄花百合生理特性的影响。结果表明,随着热处理时间增加,叶片的相对电导率、MDA含量、可溶性糖含量呈现上升趋势;可溶性蛋白质含量和POD活性呈现“上升-下降-上升-下降”趋势;CAT活性呈现下降趋势。42℃不间断胁迫96 h对淡黄花百合产生了不可逆的的热激伤害。(3)淡黄花百合耐热机理分析。基于RNA-seq测序技术对42℃热处理0 h、0.5 h、2 h、12 h和48 h的淡黄花百合进行转录组测序。通过GO和KEGG数据库的比对和注释发现,热激下淡黄花百合叶片在响应逆境、氧化还原过程、蛋白质泛素化、内质网中的蛋白质加工、钙离子结合和代谢合成等生命过程中表现活跃。对热激下的差异表达基因(Differential expression genes,DEGs)进行分析,鉴定到许多热响应基因,其中有大量信号转导、转录因子、胁迫蛋白、抗氧化胁迫、抗渗透胁迫和蛋白质泛素化相关编码基因,包括Ca2+信号、HSF、MYB、ERF/AP2、b ZIP、Trihelix、MADS-box、b HLH、WRKY、NAC等转录因子编码基因、HSP、GST、NU6M、GOLS和SKIP27基因等。(4)淡黄花百合的遗传转化体系的建立和优化。适宜3、6和9 mm3抗性愈伤组织筛选的Hyg浓度分别为15、30和30 mg/L。300、350和400 mg/L分别为3、6和9 mm3愈伤组织适宜的Cef抑菌浓度。以农杆菌介导法转化携带GUS基因的DX2181质粒,当条件参数为9 mm3的愈伤组织、EHA105为菌株、预培养3 d、侵染25 min、共培养5-6 d时,稳定转化率最高。
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