前言：以红霉素为代表的大环内酯类抗生素是一类分子中含内酯结构的大环而得名的抗生素，这个内酯环通常为12-20元环，也可更多，最初的大环内酯类抗生素是从链霉菌分离出来，此后在其结构基础上陆续研究开发出一系列抗菌活性强，不良反应少的大环内酯类抗生素，如罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素等，其主要抗菌机制是阻碍细菌蛋白质的合成而发挥抑菌或杀菌作用。自从工藤翔二等学者首先报道长期小剂量红霉素治疗弥漫性泛细支气管炎(diffusepanbronchiolitis，DPB)取得明显效果以来，大环内酯类抗生素的抗炎活性逐渐成为研究热点。　　 在DPB患者支气管肺泡灌洗液(Bronchioalveolar Lavage Fluid，BALF)中，T淋巴细胞绝对数明显高于正常对照组，DPB组织病理特点是淋巴细胞、浆细胞及组织细胞等浸润致管壁增厚，伴有支气管相关淋巴组织(bronchus-associatedtissue，BALT)增生，明显高于其它呼吸道疾病，加之肉芽组织及瘢痕灶的形成致呼吸性细支气管壁增厚、管腔狭窄和闭塞，继而引发细支气管扩张。DPB病理结果显示，除中性粒细胞外，淋巴细胞在DPB发生和发展过程中也是十分重要的细胞成分。T细胞可通过分泌多种与炎症形成有关的细胞因子，如TNF-α、白细胞介素IL-2和IL-1等细胞因子，同时，T淋巴细胞自身也可分泌一种趋化多种炎性细胞的趋化性细胞因子-巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatoryprotein-1α，MIP-1α)[18，23]，所产生的细胞因子反过来又可激活淋巴细胞，免疫活化的淋巴细胞分别产生淋巴因子或抗体，造成炎症反应周而复始，连绵不断，呈慢性经过，故T淋巴细胞对DPB的发生和病理的持续性进展起着重要作用，并且已有研究表明DPB患者存在T淋巴细胞凋亡不足的现象。　　 MIP-1α是T淋巴细胞及多种炎性细胞分泌的一种趋化性细胞因子，能趋化多种炎性细胞，其在激活淋巴细胞，促使其黏附于血管内皮而迁移和建立化学趋化梯度的过程中起着重要作用。已有研究表明在DPB患者BALF中MIP-1α明显高于正常对照组。　　 鉴于T淋巴细胞及其分泌的趋化性细胞因子-MIP-1α在炎症反应中的重要作用，我们将其引入DPB的系列研究，比较十四元环红霉素(erythromycin，EM)和十五元环阿奇霉素(azithromycin，AZM)对T淋巴细胞增殖和MIP-1α表达的影响，以探讨大环内酯类抗生素治疗DPB的作用机理。　　 实验方法　　 第一部分基础实验部分　　 1、EM和AZM对T淋巴细胞MIP-1α表达的影响：用10％胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)DMEM培养液(100u/mL青霉素，100μg/ml链霉素)体外培养人T淋巴细胞(Jurkat T cell)，各孔中加入5种浓度(6.25、12.5、25、50和100μg/mL)的红霉素或阿奇霉素，两种药物溶解于二甲基亚枫(dimethyl sulfoxide，DMSO：终浓度<0.1％)中并设立阴性对照孔培养24h后，收集细胞采用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)方法测定MIP-1αmRNA的表达，上清用于酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)进行MIP-1α蛋白的测定。　　 2、EM和AZM对T淋巴细胞调亡的影响：用10％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)RPMI1640(100u/mL青霉素，100μg/ml链霉素)体外培养人T淋巴细胞(Jurkat T cell)，按照12.5μg/mL、100μg/mL和200μg/mL3种浓度分别加入红霉素或阿奇霉素，两种药物溶解于DMSO(终浓度<0.1％)，同时设立只加DMSO而不加上述药物的阴性对照孔培养48h。采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测淋巴细胞凋亡，Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达。　　 3、统计学处理：实验重复次数≥3次，实验数据用均数士标准差表示，用SPSS12.0软件包的配对t检验进行处理。P<0.05为差异有统计学意义。　　 第二部分临床病例研究部分　　 EM和AZM对DPB患者T淋巴细胞调亡的影响：(1)、分离DPB患者外周静脉淋巴细胞及体外培养：收集初次诊断的DPB病例(未应用过红霉素及阿奇霉素等相关药物)，抽取新鲜外周静脉血于无菌肝素锂抗凝血试剂管中，2小时内体外采用淋巴细胞分离液无菌过程分离淋巴细胞并将细胞用10％FBS细胞培养液(100u/mL青霉素，100μg/ML链霉素)稀释培养。(2)、观察EM和AZM对DPB患者T淋巴细胞调亡的影响：按照12.5μ/mL、100μ/mL和200μg/mL3种浓度分别加入红霉素或阿奇霉素，两种药物溶解于DMSO(终浓度<0.1％)，同时设立只加DMSO而不加上述药物的阴性对照孔培养48h。采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测淋巴细胞凋亡，Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达。(3)、统计学处理：实验重复次数≥3次，实验数据用均数±标准差表示，用SPSS12.0软件包的配对t检验分析进行处理。P<0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果　　 一、基础实验结果　　 1、EM和AZM对T淋巴细胞MIP-1α表达的影响：RT-PCR结果显示红霉素或阿奇霉素均可抑制MIP-1α的mRNA相对表达(P<0.05)。阿奇霉素和红霉素在12.5μg/mL时的表达水平降低较明显，阴性对照组MIP-1α的mRNA相对表达值1.094±0.08，阿奇霉素作用后MIP-1αmRNA相对表达值0.91±0.09，红霉素作用后MIP-1αmRNA相对表达值0.96±0.06。ELISA实验结果显示各化合物上清液MIP-1α蛋白表达与阴性对照组比较均有下降，差异有统计学意义(P<0.05)，其中在12.5μg/mL时蛋白水平的表达降低较明显，阿奇霉素使MIP-1α下降41％，红霉素使之降低35％。　　 2、EM和AZM对T淋巴细胞调亡的影响：流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测显示，红霉素(100μg/mL和200μg/mL)、阿奇霉素(100μg/mL和200μg/mL)有诱导细胞凋亡活性(P<0.05)，其中阿奇霉素较红霉素作用明显，二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。而12.5μg/mL组两抗生素未呈现明显的细胞凋亡(P>0.05)，从细胞凋亡角度解释了第一部分实验中EM和AZM在低剂量(12.5μg/mL)抑制.MIP-1α表达的作用可能与其诱导细胞凋亡作用无关。Westernblot检测凋亡相关蛋白表达；随EM/AZM浓度的增加Active Caspas--3蛋白表达逐渐增加，使Bcl-2蛋白表达逐渐减少，AZM使Bax蛋白逐渐增加，而EM使Bax蛋白表达不变。　　 二、临床实验结果　　 EM和AZM对DPB患者T淋巴细胞调亡的影响；流式细胞仪AnnexinV/PI法检测显示，红霉素及阿奇霉素对临床初诊DPB患者外周血T淋巴细胞具有诱导凋亡作用，实验组(100和200μg/mL)细胞凋亡率增加(P<0.05)，其中AZM较EM明显，二者之间差异有统计学意义(P<0.05)，12.5μg/mL组两抗生素未呈现明显的细胞凋亡(P>0.05)，基础及临床的细胞实验均从细胞凋亡角度解释了第一部分实验中EM和AZM在12.51μg/mL抑制MIP-α表达的作用可能与它们诱导细胞凋亡的作用无关。Western blot检测凋亡相关蛋白表达显示随EM/AZM浓度的增加Active Caspase-3蛋白表达逐渐增加，Bcl-2蛋白表达逐渐减少，Bax蛋白表达不变。由于NF-kB在多种炎性细胞因子产生与释放和炎症细胞的凋亡中均具有重要意义，并已有文献报道大环内酯类抗生素具有抑制T淋巴细胞NF-kB活化作用，我们推测EM和AZM在12.5μg/mL抑制MIP-1α表达及在100μg/mL、200μg/mL诱导细胞凋亡的效应可能是通过抑制NF-kB活性实现的，两种效应可能作用的靶点不同。具体机制有待进一步研究。　　 结论　　 红霉素及阿奇霉素均具有诱导T淋巴细胞凋亡的作用，其中阿奇霉素较红霉素作用明显。EM、AZM可使T淋巴细胞Bax/Bcl-2蛋白的比值上调，活性Caspase-3蛋白表达增加，推测AZM和EM通过调节Bcl-2和Bax蛋白的表达激活Caspase-3，使处理后的细胞呈程序性死亡，从而对DPB患者T淋巴细胞有诱导凋亡作用。　　 红霉素和阿奇霉素还可通过抑制T淋巴细胞MIP-1α的产生，降低对各炎性细胞包括淋巴细胞的趋化聚集，减少与DPB的病理过程密切相关的炎性细胞因子的产生与释放，从而减轻炎症反应，目前尚未见到有关MIP-1α药物抑制剂的报道，因此，大环内酯类化合物对MIP-1α功能的影响是探索该类化合物抗炎作用机制的一个全新的切入点和角度，并为研发治疗炎症性疾病的新药提供新的作用靶点。上述研究表明大环内酯类抗生素治疗DPB可能通过多种途径发挥作用。