第一部分梗阻性黄疸患者血清样本双向凝胶电泳技术的建立目的建立能够有效筛选梗阻性黄疸患者血清样本中差异蛋白的双向凝胶电泳技术。方法选择有梗阻性黄疸的胆管癌和胆管结石患者各3例，收集空腹血清，进行常规预处理后冷冻保存，应用Albumin and IgG Removal Kit去除血清中高丰度蛋白、胆红素和胆盐等成份，双向凝胶电泳技术分离血清蛋白样本，蛋白分离凝胶采用考马斯亮蓝染色，ImageScanner^TM凝胶扫描仪成像系统获取并保存图像。结果获得了合并梗阻性黄疸的胆管癌和胆管结石患者的重复性好、分辨率高的血清蛋白样本双向凝胶电泳图谱。结论双向凝胶电泳-质谱技术能够有效地分离和鉴定梗阻性黄疸患者的血清蛋白，这项技术为对比分析胆管癌和胆管结石患者血清蛋白的差异、筛选胆管癌特异性肿瘤标志物提供了方法学基础。第二部分人胆管癌血清差异蛋白的质谱鉴定目的通过双向凝胶电泳-质谱技术寻找梗阻性黄疸患者血清中的胆管癌相关蛋白。方法选择有梗阻性黄疸的胆管癌和胆管结石患者各10例，应用双向凝胶电泳技术-质谱技术分离其血清蛋白样本，筛选出差异表达的蛋白点，应用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术进行质谱鉴定，并通过蛋白质数据库查询质谱鉴定结果，获得差异蛋白的详细信息。结果对比分析胆管癌和胆管结石患者血清蛋白的双向凝胶电泳分离图谱，发现25个差异蛋白质点并选取进行质谱鉴定，其中20个差异蛋白质点获得成功鉴定，鉴定成功率80％；去除相同重复蛋白质后，有8种差异蛋白在胆管结石患者血清中高表达，分别为转铁蛋白、转铁蛋白A链、PRO2619、PRO1400、PRO2675、人血清白蛋白变构体、人血清白蛋白类似物和假设蛋白，有7种差异蛋白在胆管癌患者血清中高表达，分别为纤维蛋白β、纤维蛋白原γ、纤维蛋白原γ片段、α1-抗胰蛋白酶、补体C3的A链、人血红蛋白A链和未命名蛋白产物。结论胆管癌与胆管结石患者的血清蛋白中存在较多差异表达的蛋白质，利用双向凝胶电泳技术有望筛选出与胆管癌相关的肿瘤标志物。在筛选出的差异蛋白中可能与胆管癌相关的有纤维蛋白β、纤维蛋白原γ、纤维蛋白原γ片段、α1-抗胰蛋白酶、补体C3的A链、转铁蛋白、转铁蛋白A链和PRO2619，它们在胆管癌发生与演进中所起的作用以及在胆管癌诊断中的价值尚有待进一步验证。第三部分人胆管癌血清标志物AAT、PRO2619和TF的组织学验证实验目的检测双向凝胶电泳-质谱技术筛选出的部分胆管癌相关蛋白α₁-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）、PRO2619和转铁蛋白（transferrin，TF）在胆管癌组织中的表达，分析AAT、PRO2619和TF的表达与胆管癌临床病理特性的关系，探讨它们在胆管癌发生和演进过程中的作用。方法用免疫组织化学方法检测AAT、PRO2619和TF在胆管癌组织和正常胆管组织石蜡标本切片中的表达水平，分析它们与胆管癌临床病理特性关系，以及三种蛋白在胆管癌组织中表达情况是否具有相关性。结果1．AAT在胆管癌组织中的阳性表达率为83．3％，在正常胆管组织中的阳性表达率为47．4％，二者差异有统计学意义P＜0．05)；PRO2619在胆管癌组织中的阳性表达率为40．5％，在正常胆管组织中的阳性表达率为78．9％，二者差异有统计学意义（P＜0．05）；TF在胆管癌组织中的阳性表达率为47．6％，在正常胆管组织中的阳性表达率为57．9％，二者差异无统计学意义（P＞0．05）。2．AAT在胆管癌组织中的表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移无明显关系（P＞0．05），与癌组织分化程度、周围浸润和UICC分期有明显关系（P＜0．05）。3．PRO2619在胆管癌组织中的表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移、周围浸润及UICC分期均无明显关系（P＞0．05），与癌组织分化程度有明显关系（P＜0．05）；4．TF蛋白表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移、周围浸润和UICC分期均无明显关系（P＞0．05）。5．AAT、TF、PRO2619在胆管癌组织中的表达情况之间无相关性（P＞0．05）。结论1．AAT在胆管癌组织中表达增高、PRO2619在胆管癌组织中表达降低，并与胆管癌某些临床病理特性存在明显关系，说明AAT和PRO2619可能与了胆管癌的发生和恶性演进过程有关，特别是PRO2619的变化，有可能是胆管癌发生早期的分子改变。TF可能与胆管癌发生、发展和演进过程的关系不大。2．在胆管癌发生、发展和演进过程中，AAT、TF和PRO2619所发挥的作用可能不具有相关性。第四部分人胆管癌血清肿瘤标志物AAT、TF与传统诊断方法的临床对比研究目的分析本研究所筛选的胆管癌血清肿瘤标志物AAT、TF的血清学验证情况，并与传统血清肿瘤标志物CEA、CA19-9以及超声、CT和MRI／MRCP等影像学检查进行对比，探讨检测血清中AAT、TF在胆管癌诊断中的价值，以及如何通过应用综合手段提高胆管癌早期诊断水平。方法1．应用免疫散射比浊法检测胆管癌和胆管结石患者术前血清中AAT、TF水平以及CEA、CA19-9水平，对比两组之间的差异。2．应用免疫散射比浊法检测胆管癌患者术前和根治性切除术后1个月时血清中AAT、TF水平以及CEA、CA19-9水平，对比术前、术后的差异。3．将AAT、TF在胆管癌中的诊断应用情况与CEA、CA19-9以及超声、CT、MRI／MRCP等影像学诊断检查、术后病理结果进行对比分析，初步评判AAT、TF在胆管癌诊断中的临床应用价值。结果1．胆管癌患者术前血清中AAT、TF、CA19-9、CEA含量分别为2．60±0．53 g／L、1．98±0．48 g／L、45．74±9．8 ku／L、28．34±4．3μg/L，而胆管结石患者术前血清中AAT、TF、CA19-9、CEA含量分别为1．63±0．39 g／L、1．98±0．48 g／L、18．20±3．6 ku／L、4．83±1．6μg／L，两组间四种指标的差异均具有统计学意义（P＜0．05）。2．胆管癌患者根治性术后血清中AAT、TF、CA19-9、CEA含量分别为1．93±0．33g／L、2．08±0．26 g／L、33．27±4．2 ku／L、9．83±2．2μg／L，与术前结果相比，AAT、CEA、CA19-9三项指标存在显著性差异，具有统计学意义（P＜0．05），而TF值手术前后的差异不具有统计学意义（P＞0．05）。3．AAT、TF、CA19-9、CEA、四项指标联合并联检测和四项指标联合串联检测对胆管癌诊断的敏感性分别为80％、45％、75％、45％、95％和35％；以胆管结石患者为对照，诊断特异性分别为95％、70％、95％、90％、65％和100％；阳性预测值94％、60％、94％、82％、73％和100％；阴性预测值83％、56％、79％、62％、93％和61％；假阳性率5％、30％、5％、10％、35％和0％；诊断准确度分别为87．5％、72．5％、85％、67．5％、80％和67．5％。4．各种影像学检查中，US、CT、MRI／MRCP的肝内外胆管扩张发现率分别为94．4％、95％、100％，肿块显示率分别为66．7％、65％、75％，定位诊断准确率分别为61．1％、65％、75％，定性诊断准确率分别为44．4％、55％、66．7％。结论1．检测外周血清中AAT、TF的值可能对胆管癌的诊断具有一定价值，其中AAT在胆管癌诊断与监测的价值可能与CA19-9近似。2．MRI／MRCP对胆管癌定位和定性诊断优于US、CT，是胆管癌术前可靠的影像学诊断手段。3．目前胆管癌的诊断步骤可归结为，血清学检测CA19-9、AAT等肿瘤标志物结合临床资料进行初步筛选，然后采用MRI/MRCP或CT进行定位诊断。4．通过蛋白质组学技术可以发现较多胆管癌血清肿瘤标志物，但目前筛选出的任何单一胆管癌标志物可能均难以提高胆管癌的早期诊断率。小结本课题从比较蛋白质组学的主要方法——双向凝胶电泳技术着手，以合并梗阻性黄疸的胆管癌和胆管结石患者为研究对象，筛选出两种疾病血清中的差异蛋白质，并进行质谱鉴定。根据文献研究结果，选择在胆管癌患者血清表达增强的α₁-抗胰蛋白酶和胆管结石患者血清中表达增强的PRO2619、转铁蛋白，应用免疫组织化学方法进行组织学验证，分析它们与胆管癌发生和演进的关系；然后选择α₁-抗胰蛋白酶和转铁蛋白进行血清学验证，分析它们在胆管癌诊断中的应用价值。本研究获得以下结论：1．本课题以梗阻性黄疸患者的血清为研究对象，应用双向凝胶电泳技术分离并鉴定差异表达的血清蛋白。结果显示，通过相应的标本预处理技术，双向凝胶电泳方法可以有效的筛选出梗阻性黄疸患者血清中的差异蛋白，其中有些蛋白可能与胆管癌的发生发展有关，且有可能是胆管癌发生中的早期分子事件。2．通过免疫组织化学技术，对筛选出的部分差异蛋白进行了组织学验证，分析α₁-抗胰蛋白酶、PRO2619和转铁蛋白在胆管癌发生发展中可能所起的作用。3．通过免疫散射比浊法对筛选出的部分差异蛋白进行了血清学验证，并与传统血清学指标和影像学方法进行对比，分析α₁-抗胰蛋白酶和转铁蛋白在胆管癌临床诊断中的应用价值。4．通过双向凝胶电泳-质谱技术，我们可以从胆管癌患者的血清中筛选出较多的肿瘤标志物，但目前筛选出的任何单一胆管癌标志物尚难以提高胆管癌的早期诊断率；血清蛋白质组合诊断模式和联合应用这些肿瘤标志物开发出微流控检测芯片，可能是未来提高胆管癌早期诊断率的新途径。