病毒性心肌炎好发于青少年儿童,大多数可以自愈或治疗后完全恢复,不留后遗症。但也有一部分人容易反复患心肌炎或心肌炎的预后不良,迁延反复,最后形成慢性心肌炎,甚至扩张型心肌病、心力衰竭。病毒性心肌炎的常见病原体是柯萨奇病毒,尤其以B3最为常见。本实验室长期从事病毒性心肌炎的发病机制研究,用柯萨奇病毒B3病毒腹腔注射可以在Balb/c小鼠上诱导出急、慢性病毒性心肌炎甚至扩张型心肌病。病毒性心肌炎是以CD4+T细胞为主介导的免疫炎症性疾病。发病共分为三个阶段,第一阶段是病毒损伤心肌细胞,第二阶段是病毒入侵引起的免疫细胞浸润心肌组织诱发的免疫反应,第三阶段是诱发自身免疫反应。所以为研究心肌炎的免疫学机制,我们使用了在无病毒条件下,用小鼠心脏肌球蛋白诱导的自身免疫性心肌炎小鼠模型。这一模型模拟了病毒性心肌炎发病的第三阶段。通过自身免疫性心肌炎小鼠模型,大量的研究表明心肌炎和各类免疫细胞密切相关。急性心肌炎时,CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等均在心肌组织中或增多。用CD4-/-敲基因小鼠或用CD4+抗体拮抗CD4+T细胞后,小鼠不能诱导出心肌炎,并且过继转移CD4+T细胞到正常小鼠可以诱导出心肌炎,所以CD4+T细胞在心肌炎的免疫机制中至关重要。初始的CD4+T细胞在不同的细胞因子微环境里可以分化为不同的亚型,在IL-12的作用下分化为Thl,转录因子是T-bet,转录蛋白是STAT4；在IL-4的作用下,分化为Th2细胞,转录因子是GATA3,转录蛋白是STAT6；在TGF-β的作用下,分化为T调节细胞,转录因子是Foxp3转录蛋白是STAT5在TGF-β、IL-6、IL-21、IL-23的作用下分化为Th17细胞,转录因子是RORγt和RORα,转录蛋白是STAT3。Thl细胞的主要作用是针对内源性病原体,Th2细胞针对过敏反应,T调节细胞以免疫耐受和抑制免疫反应为主,Th17细胞针对外源性病原体,参与炎症免疫反应。已有报道IFN-γ对心肌炎有保护作用。而Th17可以加重心肌炎症,因为在IL-17敲基因小鼠上心肌炎的炎症减轻。MHC基因对心肌炎很重要,最近发现非MHC基因对心肌炎的影响更大。因为在A.SW和B10.S小鼠间具有相同的MHC(H-2s),但它们对心肌炎的易感性不一样,A.SW小鼠的心肌炎炎症重于B10.S小鼠。所以,非MHC在心肌炎的易感性中起了关键作用。非MHC基因调节心肌炎易感性的免疫机制目前尚未有报道。本研究的目的在于阐述非MHC基因调节心肌炎易感性程度不一致的小鼠间CD4+T细胞的变化和功能、Thl和Thl7细胞在小鼠间区别及Th17细胞分化的机制包括树突状细胞在Th17细胞分化中的作用和细胞因子受体、转录因子对Th17细胞分化的影响、Eaml基因调节心肌炎易感性时IL-6受体对Th17分化的影响。我们的研究分以下四部分：第一部分,分离小鼠心肌组织中肌球蛋白,制备免疫乳剂,诱导小鼠自身免疫性心肌炎模型。肌球蛋白从180只各种不同品系的小鼠心脏中逐步分离出来,用300微克的肌球蛋白和含有5毫克/毫升的灭活的结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂(CFA)等量混合制成免疫乳剂皮下注射给小鼠以诱导实验性自身免疫性心肌炎。A.SW的心肌组织比B10.S的心肌组织炎症明显。心脏和体重比表明A.SW小鼠的心脏扩大而B10.S不明显。这两类小鼠虽然具有相同的MHC背景(H-2s),但对自身免疫性心肌炎的易感性不一样。这说明具有遗传因素的非MHC基因在自身免疫性心肌炎中起决定性作用。第二部分,分析自身免疫性心肌炎小鼠中免疫细胞的功能和数量变化,尤其是Thl和Thl7细胞。小鼠品系间免疫细胞组成的内在差异可能会影响免疫反应,从而影响自身免疫性心肌炎的易感性。A.SW小鼠的CD4+T细胞的百分比高于B10.S小鼠。相反,A.SW小鼠的CD8+T细胞的百分比低于B10.S小鼠。其他免疫细胞的百分比在两类小鼠间没有显著差别,它们分别是CD19+B细胞CD11b+ F4/80-单核细胞F4/80+ CD11b+巨噬细胞,CD11c+树突状细胞,CD3-DX5+自然杀伤细胞(NK细胞)和CD3+DX5+自然杀伤T细胞(NK T细胞)之间。免疫后,两类小鼠间表现出相似的脾细胞绝对数量动态变化曲线,第0天后细胞总数开始上升,第7天时A.SW小鼠的脾细胞数略高于B10.S小鼠但没有统计学差异,第14天时两组小鼠的细胞数量达到高峰,之后开始下降。这表明脾脏的免疫反应在免疫后的第14天达到高峰。在整个疾病过程中,A.SW小鼠的CD4+T细胞的百分比显著高于B10.S小鼠。此外,免疫后第21天,A.SW小鼠还表现出浸润在心肌组织中的CD4+T细胞多于B10.S小鼠。不但A.SW的CD4+T细胞的百分比高于B10.S,而且CD4+T细胞更易被激活和增殖,A.SW小鼠的T细胞增殖能力明显强于B10.S小鼠,CD4+T细胞的增殖能力高于B10.S小鼠即CD4+Brdu+细胞数量多于B10.S组。A.SW小鼠分泌IL-17A的CD4+T细胞明显多于B10.S。相反,B10.S小鼠分泌IFN-γ的CD4+T细胞明显多于A.SW小鼠。因此,在心肌炎中,A.SW小鼠以Th17反应为主,而B10.S小鼠以Th1反应为主。体外培养诱导脾脏来源的初始CD4+T细胞分化为Th1和Th17时,在诱导向Th1分化的条件下,B10.S CD4+T细胞分泌的IFN-γ比A.SW小鼠CD4+T细胞多。在诱导Th17分化的培养条件下,A.SW小鼠的CD4+T细胞分泌的IL-17A比B10.S小鼠的CD4+T细胞多。第三部分,树突状细胞在CD4+T细胞分化机制中的作用。本研究发现A.SW小鼠在心肌炎后第21天的心肌组织中IL-23p19显著高于B10.S小鼠,第14天的脾脏组织中IL-23p19也显著高于B10.S小鼠。IL-23是维持Th17细胞的重要因子,A.SW心肌和脾脏中IL-23的增多和其以Th17细胞反应相一致。IL-23主要由树突状细胞分泌。从A.SW和B10.S小鼠的骨髓中体外诱导培养树突状细胞,经过LPS刺激后用细胞内染色的方法发现B10.S小鼠来源的树突状细胞分泌的IL-12和TNF-α比A.SW的树突状细胞多。IL-12是Th1的细胞因子,TNF-α可以促使Th1细胞合成,所以有助于B10.S小鼠的Thl细胞合成。同时,经过LPS刺激后的树突状细胞的培养液经ELISA检测细胞因子的分泌情况。本研究观察了TGF-β1、IL-6、IL-23p19和IL-12在培养上清液中的含量。结果发现,这些细胞因子在两类小鼠间没有显著差异,但TGF-β1、IL-6在A.SW来源的树突状细胞中略增加,而IL-12在B10.S组高。IL-23p19在B10.S来源的树突状细胞中明显增加,这可能和补偿有关。经过LPS的刺激后,A.SW小鼠的树突状细胞表达CD40和CD86高于B10.S小鼠的树突状细胞。可见,A.SW来源的树突状细胞更容易被刺激后成熟。第四部分,心肌炎易感小鼠的Th17细胞分化机制。转录因子对细胞的分化起决定性作用。我们观察到在A.SW小鼠的初始CD4+T细胞中转录因子RORγt明显高于B10.S小鼠。TGF-β和IL-6共同作用可以使初始CD4+T细胞分化为Th17细胞。A.SW小鼠初始CD4+T细胞上IL-6Ra的表达高于B10.S小鼠。实时PCR的方法检测CD4+T细胞的TGF-βRl受体表达,两类小鼠间没有明显差异。本研究分离了小鼠脾脏中初始CD4+T细胞,在体外进行Th17的诱导培养,培养液中分别加入了TGF-β1和IL-6诱导因子。第5天收集Th17细胞检测发现IL-6Rα、IL-6和TGF-βR1在A.SW组明显高于B10.S小鼠。TGF-βR1在初始的CD4+T细胞上两类小鼠间没有发现差别,但CD4+T细胞诱导成为Th17细胞后A.SW小鼠组高于B10.S小鼠组。IL-6Rα在A.SW小鼠的初始CD4+T细胞和经过诱导后的Th17细胞上均高于B10.S小鼠。分析Th17细胞上IL-21的基因表达,结果发现A.SW小鼠和B10.S小鼠间没有差异,IL-21受体的表达在A.SW和B10.S小鼠间也没有发现差别。IL-23受体在A.SW和B10.S的Thl7细胞上也没有区别。可见IL-6受体a在Th17的分化形成中起了关键作用。因为A.SW小鼠易感心肌炎而B10.S小鼠对心肌炎的易感性低,并且本实验室前期的简单序列长度多态性(SSLP)分析发现1号染色体近端控制了对自身免疫性心肌炎的易感性,并把这一段命名为Eaml。所以我们用speed congenics的方法,繁殖出带有A.SW小鼠来源的Eamml基因,但其余的1号染色体基因和其他染色体均来自于B10.S小鼠,命名为B10.A.Eam1小鼠。B10.A.Eaml小鼠经过肌球蛋白免疫后自身心肌炎的炎症程度介于A.SW和B10.S小鼠间。我们发现其脾脏的CD4+T细胞百分比数量介于A.SW和B10.S小鼠间。B10.A.Eam1的脾脏来源的初始CD4+T细胞的IL-6Rα的表达介于A.SW和B10.S小鼠之间。综上所述,自身免疫性心肌炎的易感性和Th17细胞有关并且受非MHC基因调节。Eaml基因调节初始CD4+T细胞的IL-6受体α,影响了Th17的分化,从而增加心肌炎的易感性。本课题首次阐述了心肌炎的易感性受非MHC基因调节,Th17免疫反应促进心肌炎症。所以,从非MHC基因角度调节Th17细胞的分化和功能为临床诊治心肌炎病人提供新的方法,从遗传基因角度提供心肌炎的诊治参考。