论文部分内容阅读
研究背景和目的:口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC）是一种常见的口腔颌面部恶性肿瘤,传统的OSCC治疗方法以手术配合放化疗为主。然而,口腔颌面部是既关系到美观,同时还承担着咀嚼、发音、吞咽和腺体分泌等重要功能的特殊部位,手术切除往往会从生理和心理上给患者带来不可逆的损伤;放疗、化疗以及其他针对肿瘤的辅助治疗手段不仅具有一定毒副作用,也通常难以实现对OSCC的彻底治愈。因此,诸如光学疗法、基因疗法、免疫疗法和分子靶向药物等新兴的抗肿瘤方式得到了越来越多的关注。光学疗法包括光热疗法（Photothermal therapy,PTT）和光动力疗法（Photodynamic therapy,PDT）,原理为利用光热转换剂或光敏剂在相应波长激发光照射下触发升温效应和活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）的大量产生,进而发挥直接杀伤肿瘤细胞、关闭肿瘤新生血管和激活机体的抗肿瘤免疫等治疗作用。PTT和PDT相比于传统OSCC疗法具有无创或微创、可控且不易产生耐药等优势。利用纳米载药体系将光敏剂与光热转换剂进行负载,同时共载化疗药物、基因等治疗因子,并对纳米粒子进行进一步的靶向性修饰,不仅可以克服游离药物毒副作用较大、稳定性和肿瘤选择性较差等缺陷,提升药物对肿瘤的精准递送效率,还可实现不同疗法之间的协同联合抗肿瘤作用,在OSCC治疗方面具有广阔的应用前景。本研究为实现光学疗法与其它治疗方法（化疗与基因治疗）联合对抗OSCC,设计了两种结构简单且功能多样的纳米载药体系:1.以具备OSCC靶向性的多肽（cycle RGD,c RGD）为靶向性配基,以具有ROS响应性断键能力的酮缩硫醇（Thioketals,TL）为连接桥,构建基于氨基化聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）的共载光敏剂血卟啉（Hematoporphyrin,HP）和化疗药物阿霉素（Doxorubicin,DOX）且兼具OSCC靶向性与ROS响应释药性能的多功能纳米载药体系（c RGD-PEG-TL-DOX/HP,RPTD/HP纳米粒）,以实现对两种治疗剂的精准递送和控制释放,并联合PDT与化疗高效抑制OSCC的体内外生长。2.以聚氨基酯（Poly（β-aminoester）s,PBAE）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）为载体材料,以同源肿瘤细胞膜（Cancer cell membrane,CCM）为靶向修饰材料,构建共载兼具光敏与光热性能的近红外荧光染料吲哚菁绿（Indocyanine green,ICG）和抗氧化应激转录因子——核因子E2相关因子2（NF-E2-related factor,Nrf2）的干扰RNA（Nrf2-si RNA）的多功能仿生纳米载药体系（CCM@PBAE/PLGA/ICG-Nrf2-si RNA,M@PPI-si RNA纳米粒）,通过同源肿瘤靶向递送治疗剂和调控OSCC细胞内氧化抵抗机制来放大PDT效应,实现PTT/PDT与基因疗法的协同抗肿瘤作用。本论文将主要从多功能纳米体系的制备和表征,及其在细胞和动物水平对OSCC的抑制作用评估与作用机制探究几个方面进行系统研究。实验方法:第一部分具有OSCC靶向性与ROS响应性的多功能纳米载药体系的研究1.制备及其体外表征:将DOX与PEG通过ROS响应性化学键TL偶联合成PTD,而后c RGD分子中的巯基与PTD分子末端的马来酰亚胺发生加成反应,合成抗肿瘤靶向性前药RPTD;运用核磁共振波谱法（Nuclearmagnetic resonance spectroscopy,1H NMR）和红外光谱分析法（Infrared spectroscopy,IR）考察PTD与RPTD的化学结构;在H2O2溶液中考察PTD分子中TL的ROS响应性断键性能;以RPTD为载体材料,采用纳米沉淀法制备携载光敏剂HP的多功能纳米体系RPTD/HP纳米粒;利用透射电镜观察纳米粒的形貌,采用动态激光散射法检测纳米粒的粒经及其分布;通过荧光光谱法验证RPTD和HP分子间的π-π共轭作用,采用SOSG荧光探针法考察RPTD/HP纳米粒在激光照射下触发ROS生成的能力,并利用体外动态透析法考察RPTD/HP纳米粒的ROS响应性释药能力。2.RPTD/HP纳米粒的体外抗肿瘤作用评价:采用激光共聚焦显微镜和流式细胞术考察OSCC细胞系CAL-27及人口腔上皮细胞系HOEC对PTD/HP和RPTD/HP纳米粒的摄取情况及其激光照射下DOX的亚细胞分布,体外考察RPTD/HP纳米粒的OSCC靶向性;运用ROS荧光探针DCFH-DA检测RPTD/HP纳米粒在CAL-27细胞中触发ROS产生的情况,体外评价其PDT效应;采用荧光探针法考察CAL-27细胞中线粒体的损伤水平,采用免疫荧光技术考察细胞色素c（Cytochrome c,Cyt c）的亚细胞分布,初步探讨PDT诱导细胞凋亡的作用机制;考察RPTD/HP联合激光照射对CAL-27细胞体外生长的抑制、细胞凋亡的诱导以及细胞周期的阻滞作用,评价纳米粒联合PDT与化疗的协同抗肿瘤疗效。3.RPTD/HP纳米粒的体内抗肿瘤作用评价:通过在Balb/c裸鼠皮下注射CAL-27细胞构建OSCC小鼠模型;采用近红外荧光染料Cy5.5标记PTD/HP和RPTD/HP纳米粒,尾静脉注射给药后于小动物活体成像系统下观察PTD/HP/Cy5.5与RPTD/HP/Cy5.5纳米粒在小鼠体内的组织分布及其在肿瘤部位的滞留能力,体内评价RPTD/HP纳米粒的OSCC靶向性;对荷瘤小鼠采用尾静脉注射给药和肿瘤局部激光照射的治疗方式,每5 d治疗1次,持续治疗4次;治疗期间监测荷瘤小鼠的体重和肿瘤的体积;治疗结束后取主要器官和肿瘤进行组织病理学分析,包括苏木精/伊红染色（H&E）和CD31免疫组化染色,综合评价RPTD/HP纳米粒联合PDT与化疗对CAL-27荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用。第二部分同源OSCC细胞膜修饰的多功能纳米载药体系的研究1.制备与体外表征:以PBAE与PLGA为载体材料,采用复乳法制备携载光敏剂ICG的PPI纳米粒;利用PPI纳米粒与Nrf2-si RNA之间的正负电荷吸附作用制备PPI-si RNA复合纳米粒;提取OSCC细胞系SCC-25的CCM,并采用挤压法实现CCM在PPI-si RNA纳米粒表面的包覆,制备M@PPI-si RNA纳米粒。通过透射电镜观察纳米粒的形貌;采用动态激光散射法检测纳米粒的粒径及其分布,检测其Zeta电位;利用琼脂糖凝胶电泳实验探索PPI纳米粒与Nrf2-si RNA复合的最佳比例;采用SDS-PAGE凝胶电泳实验考察M@PPI-si RNA纳米粒对CCM相关蛋白的保留情况;采用紫外分光光度法检测纳米粒的载药情况;利用红外热成像仪和活性氧探针ABDA考察激光照射下M@PPI-si RNA的升温效应和促ROS生成能力,评价其体外PTT与PDT效应。2.M@PPI-si RNA纳米粒的体外抗肿瘤作用评价:采用激光共聚焦显微镜和流式细胞术定量检测PPI-si RNA和M@PPI-si RNA纳米粒在小鼠黑色素瘤细胞系B16、人口腔上皮细胞系HOEC和OSCC细胞系SCC-25中的摄取及其亚细胞分布情况,评价M@PPI-si RNA纳米粒的OSCC体外靶向性及其逃逸内涵体/溶酶体胞内递送Nrf2-si RNA的性能;采用免疫荧光技术考察SCC-25细胞内热休克蛋白60（Heat shock protein 60,HSP60）的表达情况,考察M@PPI-si RNA纳米粒的PTT效应;采用ROS荧光探针DCFH-DA检测SCC-25细胞中ROS的生成情况,同时采用免疫荧光染色对细胞内Cyt c与线粒体进行共定位分析,评价M@PPI-si RNA纳米粒的PDT效应,并探讨其机制;采用Western Blotting技术检测SCC-25细胞中Nrf2及其下游调控的转录基因谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCLC）和谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基（GCLM）的表达水平,探讨Nrf2-si RNA对PDT效应的助力机制;运用MTT实验、活死细胞染色及凋亡试剂盒考察激光照射下M@PPI-si RNA纳米粒对SCC-25细胞体外生长的抑制作用。3.M@PPI-si RNA纳米粒的体内抗肿瘤作用评价:通过皮下注射SCC-25细胞构建OSCC荷瘤小鼠模型;尾静脉注射M@PPI-si RNA纳米粒,随后通过活体成像系统考察其组织分布与肿瘤滞留性能,评价其OSCC体内靶向性;尾静脉注射给药后,对小鼠肿瘤进行局部激光照射,期间采用红外热成像仪考察肿瘤部位的升温效应;治疗后采用SOSG荧光探针检测肿瘤组织中ROS的生成水平;采用免疫组化法检测肿瘤组织中HSP60和Nrf2的蛋白表达水平;尾静脉注射给药结合激光照射治疗后,持续监测SCC-25荷瘤小鼠肿瘤的生长与体重变化情况,治疗结束后对小鼠主要器官与肿瘤进行病理学分析（包括H&E染色和CD31免疫组化染色）,考察M@PPI-si RNA纳米粒联合PTT/PDT和Nrf2-si RNA对OSCC的协同治疗疗效。研究结果:第一部分具有OSCC靶向性与ROS响应性的多功能纳米载药体系的研究1.成功合成RPTD,并通过IR和1H NMR对其化学结构进行了确证;RPTD具有两亲性,能够与疏水性光敏剂HP在水性介质中通过π-π共轭与疏水相互作用组装形成RPTD/HP纳米粒,进而实现对HP和DOX的有效共载;RPTD/HP纳米粒呈球状形貌,粒径和分散系数（Polydispersity index,PDI）分别为186.2 nm和0.156,在体外具有良好的分散性和稳定性,激光照射能够诱导纳米粒生成大量ROS,表现出显著的PDT效应。RPTD分子中的TL连接键在H2O2溶液中能够高效断键,激光照射可以促发RPTD/HP纳米粒中DOX的快速释放,证实该纳米体系具有ROS响应性释药性能。2.在CAL-27细胞中,RPTD/HP纳米粒的摄取水平明显高于PTD/HP纳米粒,而HOEC细胞对两种纳米粒的摄取无显著差异,证明是c RGD的表面修饰介导了RPTD/HP纳米粒对OSCC细胞的靶向性。激光照射下,RPTD/HP纳米粒触发了CAL-27细胞中ROS大量生成,进而表现出线粒体膜的损伤和Cyt c从线粒体向细胞质中的释放。产生的ROS可以促使DOX从解体的纳米粒中释放和入核,进而在细胞杀伤、细胞凋亡及细胞周期阻滞等方面表现出显著的PDT与化疗的协同效应。3.经尾静脉注射给药后,RPTD/HP/Cy5.5纳米粒在CAL-27荷瘤小鼠体内表现出明显优于PTD/HP/Cy5.5纳米粒的肿瘤靶向与滞留能力;8 h后在肿瘤中蓄积,24 h后主要滞留于肿瘤病灶,进一步说明c RGD的表面修饰赋予了RPTD/HP纳米粒对OSCC的主动靶向性。荷瘤小鼠体内治疗实验结果显示,RPTD/HP纳米粒结合激光照射能够在最大程度上抑制小鼠体内肿瘤的生长,诱导肿瘤细胞凋亡或坏死,抑制肿瘤血管的新生,说明RPTD/HP纳米粒的OSCC靶向性能和ROS响应性释药性能有利于其发挥PDT与化疗的协同抗肿瘤效应。治疗过程中小鼠体重无显著变化,治疗结束后主要器官无病理学损伤,说明基于RPTD/HP纳米粒的协同治疗策略具有良好的体内安全性。第二部分同源OSCC细胞膜修饰的多功能纳米载药体系的研究1.制备的PPI和PPI-si RNA纳米粒具有球状形貌与致密的内部结构,平均粒径分别为159.4 nm和168.3nm,Zeta电位为+43.6和+26 m V;ICG在PPI纳米粒中的负载量和包封率分别为1.9%和91.8%;从SCC-25细胞中提取CCM,并采用挤压法成功包覆于PPI-si RNA纳米粒表面,制备获得M@PPI-si RNA纳米粒,粒经为190.5 nm,Zeta电位为?38 m V;PPI纳米粒对Nrf2-si RNA具有高效吸附能力,而M@PPI-si RNA则成功保留了CCM表面的蛋白特征;激光照射下,M@PPI-si RNA纳米粒表现出显著的升温效应和ROS促生成作用,说明其具有良好的体外PTT和PDT性能。2.B16和HOEC细胞对PPI-si RNA和M@PPI-si RNA纳米粒的摄取无显著差异,但SCC-25细胞对M@PPI-si RNA纳米粒的摄取能力明显高于PPI-si RNA纳米粒,说明同源CCM的修饰促进了OSCC细胞对纳米粒的内化。通过M@PPI-si RNA纳米粒的递送,Nrf2-si RNA能够逃逸内涵体/溶酶体进入细胞质发挥RNA干扰效应。在SCC-25细胞中,M@PPI-si RNA纳米粒结合激光照射显著上调了HSP60的蛋白表达,并且触发了胞内ROS的大量生成,证实其具有良好的PTT/PDT效应。结合激光照射,PPI-si RNA和M@PPI-si RNA纳米粒相较于PPI纳米粒显著下调了Nrf2、GCLM与GCLC的蛋白表达,从而表现出更为显著的细胞杀伤和细胞凋亡诱导效应,促使了更多的Cyt c从线粒体向细胞质的释放,说明同源CCM的靶向作用和Nrf2-si RNA的抗氧化抑制作用放大了ICG的PTT/PDT效应。3.经尾静脉注射给药后,M@PPI-si RNA纳米粒在SCC-25荷瘤小鼠体内表现出明显优于PPI-si RNA纳米粒的肿瘤靶向与滞留能力,进一步说明同源CCM的表面修饰赋予了M@PPI-si RNA纳米粒对OSCC的主动靶向性。结合激光照射后,M@PPI-si RNA纳米粒诱导了体内肿瘤局部的温度升高并显著上调了其HSP60的表达水平,证实其良好的体内PTT效应;同时还触发了肿瘤组织中ROS的大量生成并下调了Nrf2的表达水平,证实其显著的体内PDT效应。荷瘤小鼠体内治疗实验结果显示,M@PPI-si RNA纳米粒结合激光照射能够显著抑制小鼠体内肿瘤的生长,诱导肿瘤细胞凋亡或坏死,抑制肿瘤血管的新生,并且表现出强于PPI与PPI-si RNA纳米粒结合激光照射治疗的体内肿瘤抑制作用,说明同源CCM介导的OSCC靶向递送与Nrf2-si RNA的抗氧化抑制效应可以发挥助力PTT/PDT的协同抗肿瘤作用。结论:本研究设计并构建了两种结构简单的多功能纳米载药体系,实现了对光敏剂和其它抗肿瘤治疗剂的高效共载、靶向递送、可控释放及其联合光学疗法（PTT和PDT）与其它治疗方法（化疗和基因疗法）对OSCC的协同抑制作用。第一种多功能纳米载药体系是以c RGD为靶向性配基,以具有ROS响应性断键能力的TL为连接桥,构建的共载光敏剂HP和化疗药物DOX,且兼具OSCC靶向性与ROS响应释药性能的RPTD/HP纳米粒,获得了联合PDT与化疗的OSCC协同抑制效应。第二种多功能纳米载药体系是同源肿瘤细胞膜表面修饰的共载ICG和Nrf2-si RNA的M@PPI-si RNA纳米粒,通过同源肿瘤靶向递送及调控抗氧化抵抗机制来放大ICG的PTT/PDT效应,获得对OSCC的协同抑制效应。综上所述,本研究为OSCC的精准治疗以及联合光学疗法和其它治疗方法提供了纳米载体平台和策略参考。