目的:　　 1初步建立起Roche454高通量测序分析人B细胞BCR CDR3受体库的技术流程和数据分析平台。　　 2观察HBV疫苗接种前、后外周血中B细胞IgG&IgM H链CDR3受体库的组成和特征。　　 方法:　　 1.在遵义医学院2008级临床医学本科的在校大学生中，用电化学发光法检测志愿者的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb血清标志物，符合乙肝五项全部阴性诊断标准的3位HBV疫苗志愿接种者。注射HBV疫苗三次(0，1，6个月，接种前及接种全程均排除自身免疫性疾病及恶性肿瘤)，于疫苗第一次接种前一天和接种第三次后14天各采集外周血15ml，提取每个样本外周血单个核细胞(peripheral blood　　 mononuclear cell，PBMC)的总RNA，逆转录成cDNA。样本序列号命名为：MID1=1号志愿者疫苗后样本；MID2=1号志愿者疫苗前样本；MID3=2号志愿者疫苗后样本；MID4=2号志愿者疫苗前样本；MID5=3号志愿者疫苗后样本；MID6=3号志愿者疫苗前样本。　　 2.采集3例HBV疫苗志愿接种者外周血5ml(EDTA-K2抗凝)，提取基因组DNA，采用PCR-SBT(Sequencing based typing.SBT)法测序HLA-A等位基因序列(华大基因完成)。　　 3.设计6条IgG&IgM H链可变区上游引物和1条IgM下游引物，1条IgG下游引物(Invitrogen合成)；根据6个样本合成6套，每条引物5’端设计10个特殊核苷酸组成的区分序列，PCR扩增各样本B细胞IgM和IgG的重链引物间的区域(含完整的CDR3区)。PCR产物电泳、割胶后，采用QIAGEN凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extration Kit)，进行纯化。　　 4. Roche454高通量测序及数据分析，6个样本测序由上海同济大学同达科信生物技术发展有限公司采用Roche454 GS-FLX System测序完成。　　 5.数据分析：通过每个样本的特征标签序列将获取的总序列分到6个样本中。按照每个样本的特殊IgG/IgM引物序列，根据IMGT数据库V-QUEST软件和编程等，初步分析各样本框架内重排(in-flame)的B细胞BCR CDR3受体库的IGHV、IGHD和IGHJ家族分布及CDR3区特征等(非框架内重排和序列的突变等B细胞BCR CDR3特征，待IMGT数据库中HighV-QUEST软件注册成功后另文分析)。　　 结果:　　 13例HBV疫苗志愿接种者接种前，乙肝五项均为阴性，完成全程接种后14天，HBV表面抗体检测全部大于10IU/L；3例志愿者的HLA-A位点分别为：AZ*0203和A*0207；A*0301和A*0207；A*2402和A*0201。　　 26个样本的Roche454测序数据共19891条：MID-1共4016条，其中完整的in-flame1368条；MID-2共2935条，其中完整的in-frame418条；MID-3共2107条，其中完整的in-frame518条；MID-4共2875条，其中完整的in-frame470条；MID-5共4840条，其中完整的in-frame1103条；MID-6共3118条，其中完整的in-frame684条。6个样本的in-frame数据在IMGT数据库中的人B细胞各IgHV、IgHJ家族均有分布，每个样本所获数据量与目前发表相关文献数据量一致。　　 36个样本in-frame CDR3受体库组成和特征初步分析：　　 (1)每个志愿者疫苗接种前、后，高频取用的IGHV、IGHD、IGHJ家族、IGHV-J家族配对和CDR3长度在一定程度上发生了改变。6个样本的IgG和IgM IGHJ家族均高频取用IGHJ4；IgM高频取用的IGHD家族均为IGHD3和IGHD6；6个样本IGHV家族取用中，MID1与MID2均高频取用IGHV3家族；MID3和MID4均高频取用IGHV1家族；MID5的IgG和IgM及MID6的IgG均高频取用IGHV4家族；MID5的IgM及MID6的IgG和IgM均高频取用IGHV1家族。但在最高取用频率的IGHV和IGHD家族中，MID2的IgG和IgM高频取用的家族分别为IGHV4/IGHD1和IGHV3/IGHD6，而MID1的IgG和IgM高频取用的IGHV家族均为IGHV3，IGHD家族分别为IGHD6和IGHD3；MID3和MID4的IgG和IgM高频取用的家族均为IGHV1，而IGHD家族分别为IGHD2和IGHD6；MID6的IgG和IgM高频取用的家族分别为IGHV1/IGHD6和IGHV5/IGHD3，而MID5的IgG和IgM高频取用的家族分别为IGHV4/IGHD4和IGHV1/IGHD6。　　 (2)6个样本的CDR3受体库重叠分析：6个样本的IgG和IgM受体库，疫苗前、后样本CDR3受体库均有一定的重叠。将MID1、MID3、MID5 CDR3受体库与NCBI数据库中部分乙肝病毒表面抗体进行比较，IGHV/J家族高频取用情况基本一致，数据库中的序列、MID1、MID3、MID5间未发现完全一致CDR3序列。　　 (3)6个样本的CDR3区氨基酸取用和长度分布分析：3例志愿者疫苗前、后氨基酸取用和长度分布均有显著变化，且MID1、MID3、MID5均以14、15个氨基酸长度处为中线，呈偏正态分布。6个样本CDR3区氨基酸的取用分析，每个志愿者均高频取用丙氨酸(10.5％-12.7％)、酪氨酸(10.4％-12.6％)、甘氨酸(10.3％-11.9％)、精氨酸(8.4％-11.4％)、天冬氨酸(9.9％-11.0％)、丝氨酸(6.4％-9.0％)。　　 (4)疫苗接种后3个样本(MID1，MID3，MID5)高频取用IGHV/D/J家族、IGHV-J配对部分相同。MID1、MID3和MID5中，IGHJ区均高频表达IGHJ4家族，而IGHV区均高频表达IGHV1和IGHV3家族，IGHV3-J4及IGHV1-J4配对被高频取用。　　 注：6个样本的测序数据中，框架内重排的CDR1，CDR2区组成特征、IGHV和IGHJ区突变的频率和特征、框架外重排的频率等等另文进行分析；发表论文数据将以IMGT High V-QUEST最后统计的数据标准进行分析。　　 结论:　　 1.本实验率先在国内初步建立起Roche454高通量测序分析人B细胞BCR CDR3受体库的技术流程和数据分析平台，为开展人B细胞相关的生理和病理研究提供了新思路和强有力工具。　　 2.本实验获得的3个人相隔6个月外周血IgG&IgM H链CDR3受体库的组成和特征数据，将为研究人B细胞CDR3提供基础比较的CDR3序列。通过HBV疫苗接种前、后V/J高频取用频率和配对、CDR3区的重叠等CDR3的组成特征及变化的初步分析，提示其和机体B细胞对HBV疫苗应答存在一定的相关性，为进一步分析HBV疫苗接种后的机体免疫应答机制等探讨提供了基础。