研究背景大肠癌(CRC)的复发与转移一直是困扰临床工作的主要问题之一,化学疗法是除手术、放疗外一个重要的治疗方法,然而,大肠癌的化疗效果并不理想,患者往往因化疗耐药导致治疗失败。以往的实验结果显示:肿瘤细胞p53突变或功能缺失与化疗敏感性降低有关。而最近的实验证明p53细胞关卡作用可作为联系不同应激与细胞应答的中间环节,通过接受多种反馈信号刺激,在肿瘤发生及药物应答中扮演重要角色。研究证实,沉默信息调节因子1(SIRT1)属于NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,可使p53蛋白去乙酰化。有实验发现90%的乙酰化p53可被SIRT1去乙酰化,p53抑癌活性降低,增加了罹患肿瘤的风险。同时,p53作为关键的转录调控因子,还可以通过调控其下游靶基因的表达,参与肿瘤各种生物学进程。因此,探讨p53及其上下游调控机制有助于进一步理解p53功能及其相关通路在肿瘤中的作用机制。近年来,p53直接靶向的非编码RNA分子micro RNA(miRNA)在转录后水平负调控基因表达引起了研究者的兴趣。已有大量研究表明在包括大肠癌在内的多种类型的肿瘤中存在p53靶向的miRNA的表达异常。其中,miR-29c作为一种肿瘤抑制性miRNA,已发现在人类多种恶性肿瘤中表达下调(如慢性淋巴细胞白血病、胃癌、肺癌、恶性淋巴瘤等)。虽然有实验结果显示miR-29c可能是p53靶基因,参与了p53依赖的肿瘤信号转导途径的调控。另外,又有实验结果显示miR-29c可能参与翻译后修饰的某些基因的表达,比如SIRT家族的调控。提示抑癌基因p53的调控可能存在着一些环路机制,但是,人们对抑癌基因p53网络调控机制尚不清楚。以往的研究,人们利用miRNA进行了大量的实验,丰富了人们对p53等抑癌基因的认识。有人认为p53与PI3K等通路之间存在着密切联系。由于肿瘤调控机制极其复杂,利用传统的实验方法难以获得清晰的解释。需要结合生物细胞学实验,进一步对p53/miRNA及其途径进行探讨。因此,本实验利用计算机软件,结合细胞生物功能检测,探讨p53是否可精准调控CRC细胞中miR-29c的表达,而miR-29c是否可通过调控其他肿瘤相关基因如SIRT1与p53在CRC中形成反馈调节,以及miR-29c是否有新型靶基因影响CRC的转移是本研究的关键。研究目的选人大肠癌HCT116 p53+/+,HCT116 p53-/-细胞为研究对象,观察miR-29c-3p在大肠癌细胞中的表达情况及其与p53间的关系。预测并证实miR-29c-3p的靶基因,并研究其对大肠癌的生物学作用。研究方法(1)利用已建立的HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-人大肠癌细胞系,应用5-FU、Act D,CCK-8及细胞凋亡试剂盒检测miR-29c-3p对细胞增殖及凋亡的影响。(2)Trans Well实验,伤口划痕实验检测大肠癌细胞侵袭与转移能力。(3)实时定量PCR检测大肠癌细胞中miR-29c-3p表达情况,分析HCT116 p53-/-细胞中过表达p53对miR-29c-3p表达的影响;比较转染miR-29c-3p的模拟物及抑制物后对HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-细胞中miR-29c-3p表达的影响。(4)蛋白质免疫印迹检测p53及其下游基因的表达,如SIRT1与PHLDB2等蛋白的表达。(5)p53 MH软件分析miR-29c基因序列中p53反应元件;生物信息学技术测算并体外细胞学实验验证miR-29c-3p的靶基因PHLDB2,研究PHLDB2对大肠癌细胞的抑制作用。(6)构建荧光素酶报告基因质粒,双荧光素酶报告基因实验检测细胞中p53对反应元件的转录调控作用及miR-29c-3p对PHLDB2的转录后调控作用。研究结果(1)蛋白质免疫印迹显示仅在HCT116 p53+/+细胞中,5-FU和Act D显著增加p53及其靶基因蛋白MDM2表达;实时定量PCR显示5-FU和Act D也相应的只在HCT116 p53+/+细胞中上调miR-29c-3p的表达;表明p53激活药物可增加miR-29c-3p的表达。(2)蛋白质免疫印迹显示转染FLAG-p53质粒后,FLAG-p53在HCT116p53-/-细胞表达呈递增状;实时定量PCR显示miR-29c-3p表达也随之递增;表明过表达p53可增加miR-29c-3p的表达。(3)P53MH软件预测得出miR-29c-3p上游含有两个高度保守的p53反应元件,并成功构建含有该两个反应元件的荧光素酶报告基因质粒。双荧光素酶报告基因实验结果表明在HCT116 p53-/-细胞中p53可正向调控p GL3-RE1,并呈剂量依赖性。得出miR-29c-3p是p53的靶基因。(4)实时定量PCR显示,在HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-细胞中转染miR-29c-3p模拟物可增加miR-29c-3p的表达,转染miR-29c-3p抑制物降低miR-29c-3p的表达。(5)CCK-8增殖实验显示miR-29c-3p模拟物在转染后第二天就对HCT116p53+/+细胞增殖有明显的抑制作用,而在HCT116 p53-/-细胞中,仅在转染后第四天对细胞增殖有明显的抑制作用。miR-29c-3p抑制物在转染后第三天开始对HCT116 p53+/+细胞增殖有明显促进作用,而对HCT116 p53-/-细胞增殖无明显作用。表明miR-29c-3p对大肠癌细胞增殖的影响呈p53依赖性。细胞凋亡实验显示与对照组相比,在HCT116 p53+/+细胞中,miR-29c-3p模拟物可提高细胞凋亡约14倍;而在HCT116 p53-/-细胞中,仅为约4倍。得出miR-29c-3p对大肠癌细胞凋亡的诱导作用在p53阳性细胞中比在p53阴性细胞中更加显著。CCK-8增殖实验显示在转染有miR-29c-3p抑制物的HCT116 p53+/+细胞经5n M Act D处理后,Act D抑制细胞增殖明显低于对照组。得出Act D对HCT116p53+/+细胞增殖的抑制作用部分依赖于miR-29c-3p。(6)蛋白质免疫印迹显示在HCT116 p53+/+细胞中转染miR-29c-3p模拟物可显著降低SIRT1蛋白表达,增加p53、p21的表达,表明过表达miR-29c-3p可以下调SIRT1,激活p53;共转染SIRT1的si RNA和miR-29c-3p模拟物后,SIRT1表达下降,与单纯转染SIRT1 si RNA相比,并未能进一步引起p53乙酰化,p53和p21蛋白上调,表明miR-29c-3p通过SIRT1激活p53;转染miR-29c-3p抑制物的HCT116 p53+/+细胞经5n M Act D处理后,p53、p21表达增加,SIRT1表达无影响,表明p53激活后,可以通过miR-29c-3p下调SIRT1;(7)在线软件发现miR-29c-3p种子区序列与PHLDB2的m RNA 3’端非编码区有7个碱基互补,表明miR-29c-3p有可能靶向调控PHLDB2的表达;(8)实时定量PCR显示在HCT116 p53-/-细胞中转染miR-29c-3p模拟物或抑制物,PHLDB2 m RNA水平无明显变化。蛋白质免疫印迹显示miR-29c-3p模拟物可降低PHLDB2的蛋白表达,相反,miR-29c-3p抑制物可显著增加PHLDB2的蛋白表达。得出PHLDB2蛋白表达水平受miR-29c-3p的调控。(9)成功构建含有野生型和突变型miR-29c-3p连接位点的荧光素酶报告质粒,经双荧光素酶报告基因实验显示miR-29c-3p模拟物仅对野生型p MIRPHLDB2呈剂量依赖性抑制作用。(10)PROGgene V2数据库分析得出PHLDB2表达量高的患者存活率、无转移存活率均低于表达量低者,得出PHLDB2表达水平与大肠癌预后呈负相关。(11)成功构建FLAG-PHLDB2表达载体,Trans Well实验、伤口划痕实验显示在HCT116 p53-/-细胞中,miR-29c-3p通过PHLDB2抑制大肠癌细胞侵袭与转移。(12)蛋白质免疫印迹显示在HCT116 p53-/-细胞中,单独转染miR-29c-3p可下调内源性PHLDB2蛋白水平。结论(1)miR-29c-3p上游包含一高度保守的功能性p53反应元件,且受p53转录因子直接调控,表明miR-29c-3p是p53的直接靶基因。miR-29c-3p在大肠癌中抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡的抗肿瘤作用呈部分p53依赖性。(2)在大肠癌细胞中,SIRT1可抑制p53的表达,而miR-29c-3p又可抑制SIRT1的表达参与p53的反馈调节,表明p53-miR-29c-3p-SIRT1-p53能够在大肠癌中形成反馈环路。(3)经在线软件及体外细胞实验证实普列克底物蛋白同源物样域家族B成员2(PHLDB2)是miR-29c-3p一个有效的靶基因,分析PROGgene V2人类癌症数据库显示PHLDB2的表达与CRC患者的存活率及无转移存活率呈负相关,进一步研究显示过表达PHLDB2可减弱miR-29c-3p对大肠癌细胞的浸润及转移的抑制作用。表明PHLDB2是miR-29c-3p下游的关键靶基因。综上,我们发现miR-29c-3p是p53的直接靶基因,并且在大肠癌中可通过SIRT1对p53形成正反馈调节,初步证实p53/miR-29c-3p环路对大肠癌细胞的增殖与转移具有调控作用。另外,PHLDB2可能作为miR-29c-3p的靶基因参与大肠癌转移,虽然我们尚不十分清楚该途径的作用机制,随着研究的深入可能会阐明PHLDB2在p53网络调控中的作用。