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第一部分曲古菌素A对唑类药物体外抗白念珠菌活性增效作用的研究第一章曲古菌素A对唑类药物体外抗白念珠菌等常见病原真菌活性的影响目的选择敏感性不同的白念珠菌菌株、组蛋白去乙酰化酶基因缺失株及其它常见病原酵母菌和丝状真菌,研究曲古菌素A对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑抗白念珠菌等常见病原真菌的活性是否有增效作用。方法微量稀释法检测0.25μg/m1曲古菌素A与氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑分别合用时对白念珠菌敏感株、耐药株和常见病原真菌的最低抑菌浓度,并检测白念珠菌的最小杀菌浓度,检测组蛋白去乙酰化酶编码基因缺失株HDA1△和RPD3△对三种唑类药物的体外敏感性。结果0.25μg/ml曲古菌素A与氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑合用可不同程度地减少白念珠菌的拖尾现象,或表现为生长孔菌量减少,少数菌株的24h最低抑菌浓度降低,对最小杀菌浓度无明显影响；曲古菌素A不影响其它常见病原酵母菌和丝状真菌与唑类药物的体外敏感性；与同源株比较,HDA1△和RPD3△,体外敏感性增加。结论曲古菌素A对唑类抗真菌药物体外抗白念珠菌活性有增效作用,对其体外杀菌作用无影响。曲古菌素A与唑类抗真菌药物合用对除白念珠菌外的常见病原酵母菌和丝状真菌的体外敏感性无增效作用。组蛋白去乙酰化酶编码基因HDA1和RPD3可能与白念珠菌体外敏感性相关。第二章曲古菌素A对唑类药物体外增效作用的机制初探目的研究白念珠菌组蛋白去乙酰化酶编码基因的表达水平,以及组蛋白去乙酰化酶编码基因和外排泵基因在体内外获得性耐药形成过程中表达水平的变化。应用罗丹明123(Rh123)检测曲古菌素A对白念珠菌外排泵功能的影响。方法体外诱导白念珠菌对氟康唑耐药,收集药物作用前的白念珠菌和氟康唑环境下的体内外获得性耐药的白念珠菌。Trizol法提取白念珠菌RNA,白念珠菌ACT1作为内参基因,荧光定量RT-PCR检测白念珠菌临床株组蛋白去乙酰化酶编码基因HDA1、RPD3、 Hos1、HOS2、HOS3的表达水平,以及组蛋白去乙酰化酶编码基因和外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1和FLU1在体内外获得性耐药形成过程中表达水平的变化。应用荧光染料Rh123处理白念珠菌,荧光分光光度计检测白念珠菌临床株、体外诱导耐药菌株在曲古菌素A作用下的荧光变化,以检验白念珠菌外排泵功能的变化。结果药物作用前,白念珠菌的组蛋白去乙酰化酶编码基因有不同程度表达,与菌株自身敏感性和曲古菌素A对菌株的增效作用无关；体内外获得性耐药形成过程中HDA1、RPD3、HOS1、HOS2和HOS3表达水平有不同程度增高,外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1表达水平呈不同程度增加,LU1表达水平变化不明显。曲古菌素A对白念珠菌临床株短时间作用后,外排泵功能无明显变化,氟康唑／曲古菌素A诱导组的Rh123荧光值高于氟康唑诱导组的Rh123荧光值。结论组蛋白去乙酰化修饰可能是白念珠菌外排泵基因水平变化的上游机制之一。第二部分念珠菌对常见抗真菌药物的体外敏感性测定第一章微量稀释法检测念珠菌对抗真菌药物敏感性的两种观察结果方法的比较目的应用微量稀释法检测念珠菌体外抗真菌药物敏感性,比较肉眼观察和体视显微镜观察结果的一致性及优缺点。方法参考CLSI的微量稀释法M27-A3,检测203株念珠菌对4种唑类药物(咪康唑、酮康唑、益康唑、联苯苄唑)及4种非唑类药物(制霉菌素、利拉萘酯、萘替芬、特比萘芬)的体外敏感性,并同时应用肉眼和体视显微镜两种方法观察结果。结果1.唑类药物：咪康唑、酮康唑、益康唑和联苯苄唑的一致性范围为：87.68%～96.06%；2.非唑类药物：制霉菌素、利拉萘酯、萘替芬、特比萘芬的一致性范围为91.63%～99.51%。3.与肉眼观察比较,体视显微镜观察结果具有以下优点：成像有立体感；可以观察到肉眼看不见的微量菌生长；易于区分待测菌和污染菌生长；4.除利拉萘酯、萘替芬和联苯苄唑外,咪康唑、酮康唑等均对念珠菌有良好的体外抑菌作用。结论对于微量稀释法体外检测念珠菌的抗真菌药物敏感性,应用体视显微镜可以辅助观察结果,且与肉眼读取结果有较好一致性,两种方法结合有助于体外抗真菌药物敏感性结果的判断。第二章卢立康唑及其它6种咪唑类抗真菌药物对常见念珠菌的体外活性检测目的评价卢立康唑及其它6种咪唑类药物对临床分离常见念珠菌的体外敏感性。方法参考CLSI的微量稀释法M27-A3方案,检测5种共183株临床分离念珠菌对卢立康唑、酮康唑、咪康唑、益康唑、克霉唑、舍他康唑、联苯苄唑7种咪唑类药物的体外敏感性。结果酮康唑、咪康唑、益康唑、克霉唑、舍他康唑和联苯苄唑的体外最低抑菌浓度范围(几何均数)分别为0.03-8(0.067)μg/ml、0.03-16(0.071)μg/ml、0.03-8(0.207)μg/ml、0.03-8(0.061)μg/ml、0.03-16(0.187)μg/ml.和0.03～>16(1.050)μg/ml。抗真菌新药卢立康唑对5种念珠菌均有较好的体外敏感性,最低抑菌浓度范围0.03～8μg/ml,几何均数为0.087μg/ml, MIC50和MIC90分别为0.06μg/ml和0.5μg/ml。包括卢立康唑在内,各受试药物均有部分菌株相对不敏感。结论除联苯苄唑外,卢立康唑等其它6种咪唑类药物均对念珠菌有良好的体外抗菌活性,但存在少数菌株相对不敏感。