论文部分内容阅读
烟草香气是衡量烟叶品质的一个重要指标，随着卷烟工业的发展，降焦减害和香气不足的矛盾日益突出，提高烟草香气品质成为育种工作的目标之一。苯丙氨酸代谢途径和非甲羟戊酸（MEP）途径中产生的多酚类物质和萜烯类物质是烟草中重要的香气前体物质。查尔酮合成酶（CHS）基因和1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）基因分别是这两种代谢途径中的关键基因，它们的过量表达、沉默抑或基因突变均可以直接或者间接的影响植物的苯丙氨酸代谢途径和MEP途径，影响烟草香气前体物质的形成，进而影响烟草香气。因此本文以特香型烟草品种“大白筋599”为材料，从基因特异性调控的角度研究CHS基因和DXS基因功能，为后续尝试研究香气物质形成的分子机制以及高香气育种奠定了基础。本文主要结果如下：（1）CHS、DXS基因的分离和定位。利用PCR技术从烟草品种“大白筋599”cDNA中分离出CHS基因（AF311783.1）和DXS基因（EU650419.1），并将DXS基因（去除终止密码子TAA）与绿色荧光蛋白（GFP）基因重组构建亚细胞定位表达载体，对DXS基因进行亚细胞定位，将其定位在了叶绿体中。（2）DXS基因干扰表达载体和CHS基因过量表达载体、干扰表达载体的构建及其遗传转化。利用酶切法成功构建了DXS基因的干扰表达载体，CHS基因的过量表达载体，采用Gateway法成功构建了CHS基因的干扰表达载体，并利用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化。利用PCR检测和GUS染色分析初步鉴定转基因烟草植株，RT-PCR检测结果表明，获得DXS基因沉默烟草植株12株，CHS基因过量表达植株13株，CHS基因沉默植株24株。（3）对转基因烟草植株和对照植株生理生化特性的研究。结果表明，DXS基因沉默表达的植株在苗期出现叶色变浅变黄，与对照植株相比，转基因植株叶片内总叶绿素含量减少了45.3%，类胡萝卜素含量减少了40.2%，证明DXS基因在MEP途径中对香气前体物质的形成有重要作用；CHS基因过量表达或沉默烟草植株的形态特征和生长发育正常，但CHS基因过量表达植株中4CL和C4H酶活性较对照植株均有所提高，而CHS基因沉默植株中这两种酶的活性下降。（4）利用高效液相色谱（HPLC）技术定量分析转CHS基因烟草中多酚物质含量。通过对超声波提取多酚物质条件的优化，确定了超声波的最适提取温度为55℃，最适宜的提取时间是25min；多酚物质含量测定结果显示，CHS基因过量表达植株叶片中多酚物质含量提高，CHS基因沉默植株叶片中多酚物质含量下降，表明CHS基因的过量表达促进了多酚物质在烟草植株中的合成和积累，CHS基因的沉默使得多酚物质在烟草植株中的合成受阻。证明CHS基因在苯丙氨酸代谢途径中对烟草香气前体物质形成有重要作用。